显微镜透射光中的科勒照明

2018-08-17 16:54:08 Pooher Inc. 374

透射光显微镜科勒照明调整是一个合乎逻辑且相对容易的过程,应该在所有严重的显微镜学生掌握之前进行实践。每次打开显微镜时,都应仔细检查以确保所有光学元件正确对齐,并确保灯泡居中,并且适当调整聚光镜和视场光阑以实现科勒照明。

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图1所示的显微镜使用高级外部光源为显微镜提供照明。除了卤钨灯外,灯罩还包含一个视场光阑和集光透镜。一个独立的电压调节器为灯提供一个可调的直流电压源,电压在5到12伏之间变化。现代显微镜通常包含内置于显微镜底座的光源,以及集光透镜和场光阑。用科勒照明的内部或外部光源调整显微镜在理论上是相似的,但是下面将描述的程序存在一定的差异。

无论是科勒,纳尔逊还是任何其他照明策略,显微镜对准的一个重要步骤是光源(通常是钨卤素灯泡)的对齐。许多现代显微镜现在都有预先居中和预先聚焦的灯,但是旧型号仍需要光源以用户为中心和聚焦。我们建议查阅用户手册,了解灯泡如何居中以及有关照明源的其他重要信息。建议使用以下步骤校准外部和内部灯泡:

内部钨卤灯

打开显微镜的灯后,请完全打开视场光阑(通常靠近显微镜的光源端口)和聚光器孔径光阑(由镜筒聚光器外壳上的套环或手柄控制)。

一些制造商提供一个磨砂玻璃滤光片来散发灯泡发出的光。该滤光片通常位于与灯壳相邻的滤光片支架中,并与显微镜的主体连接。继续进行灯对准之前,取下此滤光片。

如图2所示,在显微镜的端口放置一张白纸,磨砂玻璃,Kim-wipe或镜头清洁组织,图像清晰可见。

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使用灯罩上的调节螺丝将灯中的灯(即灯丝)旋转到灯座中,并使其前后或上下移动。 我们构建了一个交互式Java教程,用于评论灯丝对齐的基础知识。 正确操作灯罩调节组合应确保灯丝在光路中居中并聚焦在底座聚光器的孔径光阑中。

图3显示了使用上述步骤使灯丝可见时显微镜光端口的典型视图。 图3(a)中左侧的端口包含严重不对齐的灯丝,未正确定位以聚焦完全填充孔径光阑和物镜后焦平面的图像。 使用灯壳上的平移调整,灯丝进入焦点(图3(b)),然后居中在灯口内(图3(c))。 访问者和学生可以练习使用下面的交互式Java教程对齐“虚拟”灯丝:

外部钨和卤钨灯


大多数外部光源都比较老,没有预先居中的灯泡。 对准外置钨卤灯的第一步是将灯丝的图像投影到远处的纸张上,并由书或墙壁支撑。 使用调节螺丝或旋钮使灯丝绕其自身轴线旋转,并确保其位于聚光透镜和场光阑的光轴内,这是外部照明光源的一个组成部分。

将外部照明器放置在位于显微镜底座上的反射镜的正下方7-10英寸处(见图1)。 显微镜上为外部光源设计的许多反射镜是平凹的,并且具有一个平面(平面)和一个凹面。 在使用外部钨卤素光源时,请确保光源从反射镜的平坦表面反射回来。

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如图4所示,灯丝应居中放置在镜子中。通过将一张薄纸放在镜子上并可视化投影灯丝图像的位置,可以通过类似于内部灯泡的方式检查此灯丝。进行必要的调整,使外部照明器与显微镜光轴一致。在灯丝对中之后,反射镜应定位成将反射投影到底下聚光器。通过在舞台开口上放置一张薄纸进行检查。灯丝应该没有对焦,但是在舞台开口的中心正好框起来。

聚光镜和现场隔膜的对齐


旋转物镜转换器将10倍物镜置入光路中。接下来,将样品放在显微镜载物台上,使用粗调和细调聚焦旋钮对显微镜进行对焦。这应该通过在观察幻灯片的同时缓慢提升显微镜载物台来完成,直到它非常接近(但不接触!)物镜。在这一点上,舞台将不得不稍微降低,以标本为重点。这是一个重要的概念,如果进行得当,将避免物镜与标本盖玻片之间的碰撞。通过目镜观察,然后使用微调焦点旋钮缓慢降低平台,直到标本细节聚焦。标本应具有充足的对比度,并提供清晰锐利的图像。高度着色的生物组织样品非常适合在明场模式下对准显微镜,然而当显微镜配备偏振光或微分干涉对比时,也可以使用光学双折射样品。

在双目显微镜上,调整眼管以符合您的瞳距。单个融合的图像应该通过双眼可见而没有头部的显着移动,并且观看应该舒适。如果只有一个人使用显微镜,则不必经常进行这种调整。许多双目头具有与瞳孔间距相对应的分级标尺(图5),允许显微镜专家快速调整眼管而不通过它们观察(平均瞳孔间距为65毫米)。

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在现代显微镜中,眼管的调整方式类似于一副双筒望远镜。但是,在许多旧型号中,眼管在一个平面上来回滑动,调整它们可能会导致显微镜管长度发生轻微变化。无论翻译机制如何,管应定位在允许舒适观看的距离处。接下来,旋转包含分级规则或显微摄影术的目镜的目镜,直到标线上的标记出现在聚焦标本上的尖锐焦点上。如果不存在标线,旋转目镜直到标本聚焦。

应该单独对目镜进行屈光度调整。一些显微镜在每个目镜上都有一个分级刻度,表示目镜相对于目镜主体的位置。其他型号将目镜的主体固定在眼管中的固定位置,并带有销和插槽。第一步是将装有此类标记的目镜上的分级标记对齐,或将眼镜片顺时针旋转至最短焦距位置。接下来,将样品与10倍物镜对焦,然后旋转物镜,直到放大倍数较低的物镜(通常是5x)位于样品的上方。此时,请重新对焦每个眼睛镜片(不要使用显微镜粗调或微调焦距机构),直到标本处于清晰对焦状态。将20x物镜旋转到光路中,并使用精细对焦旋钮重新对焦显微镜。用5倍物镜重复屈光度目镜调整(同样不要干扰显微镜精调机构),并且应该将显微镜调整到正确的屈光度设置。这些设置因用户而异,因此如果目镜具有分级刻度以快速返回适当的调整,请记录眼镜片的位置。

正确的屈光度调节允许在用户左右眼的任何差异之间进行补偿,以便通过两个目镜使整个视野以清晰的焦点出现。这也使显微镜能够通过鼻甲中的所有不同物镜保持一致。目镜屈光度调整还可以抵消常见的视力问题,例如远视或近视,允许用户在没有眼镜的情况下查看标本。但是,这些目镜调整不能补偿散光,因此在检查标本时强迫这位眼睛缺陷的用户佩戴眼镜。

下一步是将视场光阑缓慢关闭(调整是在外部灯罩上或靠近光源端口的显微镜底座处)至其最小设置,直到在视场中仅显示模糊的轮廓(图6(a ))。底座聚光镜安装在(通常)由滚花旋钮控制的机架上,以相对于平台上下移动。调整该旋钮,直到视场光阑的叶片锐利聚焦在已经聚焦的样本的顶部,然后使用聚光镜定心螺丝将视场光阑的图像移动到视场的中心(以及光轴显微镜 - 图6(b))。

当升起或降低聚光镜以聚焦视场光阑的叶片时,光阑的聚焦图像可能会在叶片周围出现红色或蓝色光环。这是由于对聚光镜色差缺乏校正。具有良好校正的聚光镜会产生非常清晰的光阑轮廓,很少或没有颜色。视场光阑现在打开,直到大约四分之三的视场可见,然后再聚焦聚光镜(图6(c))。检查聚光镜的对齐情况并在必要时重新调整。现在打开视场光阑,直到它超出视野范围(用于观察),或者在显微摄影的情况下,超出定义拍摄区域的标线标记。将视场光阑打开更远是不必要的,并且会导致过度的眩光和对比度的损失。

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下一步是移除其中一个目镜,并将其放在显微镜的管中,如图7(a)所示。在观察管道时,打开并关闭聚光器孔径光阑,以便在物镜的后焦平面看到其图像。如果在显微镜底座的光路中安装了磨砂漫射滤光片,则会看到均匀点亮的光圈。如果在光路中没有这样的滤光片,您将会看到灯丝的图像,如图7(b)所示(用一个居中或相位望远镜代替取下的目镜,或者一个Bertrand透镜将使这种调整更容易看到)。

该操作的目的是设置孔径光阑的尺寸以最大化图像对比度并获得样本的最佳图像,而不会由于折射和衍射伪影而引起分辨率的损失。一般的经验法则是将孔径光阑设置在目镜管中看到的整个光盘尺寸的60%到90%之间。

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在某些情况下,部分封闭的孔径光阑的边缘与物镜的照明后焦平面不同心。这是由于底座聚光镜或物镜未对齐所致,因此应参考制造商的说明手册以获得正确的对中机制。一些显微镜与孔径光阑一起装在固定的中心位置,这在实验室中是不可能改变的。暗场和相位对比聚光镜通常总是会提供一个定心机制,因为这一步骤的重要方面是为这些照明方法设置显微镜。聚光器光圈应该以40x或60x物镜为中心,以避免必须将光圈与每个物镜重新对中(使用此方法,功率较低的物镜几乎总是会在可接受的范围内)。


现在Köhler照明已经建立了10倍的物镜,必须牢记,转向更高功率的物镜需要重新调整场和光阑膜片。例如,如果切换到40x物镜,您将不得不关闭视场光阑并将其重新居中(查看样本的较小区域)。另外,聚光器孔径光阑应略微打开(40倍物镜的数值孔径比10倍物镜要高)。每次改变物镜时,必须按照上述步骤调整两个隔膜。

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科勒照明的条件不适用于使用较低功率物镜的放大倍数(5倍及以下)。准备低倍率显微镜时,首先对准显微镜,并使用10倍物镜调整光路以获得适当的科勒照明。如图8所示,大多数现代显微镜聚光镜都有一个顶部镜头,可摆动出光路以供5倍放大或更低的物镜使用。其他电容器型号具有顶部镜头,可以旋下或具有用于聚光镜的旋转转盘与低放大倍数和高放大倍数的物镜一起使用。


当将摆出透镜从光路移除时,聚光器性能发生根本性改变,并且孔径光阑不再起控制照射光线的数值孔径的作用。为避免渐晕,应将聚光器孔径光阑打开至最宽的位置,并使用现场光阑控制样本对比度,该光阑现在可控制照明光线的数值孔径。


通过适当调整科勒照明显微镜,样品将被均匀无眩光的光照充分照射,从而获得良好的图像分辨率和对比度。欲了解更多信息,请参考科勒照明理论和/或显微镜照明基础知识部分。关于显微镜照明的参考材料也可以在我们的参考书目和网页资源部分找到,其中包含指向其他显微镜网站的链接。


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查看原始的英语文章:Köhler Illumination in Transmitted Light


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