显微镜知识:图像亮度

2018-08-17 16:54:24 Pooher Inc. 307

无论光学显微镜使用何种成像模式,图像亮度都受物镜聚光能力的控制,而聚光能力是数值孔径的函数。 正如显微镜源照度的亮度由聚光镜工作数值孔径的平方决定的,样本图像的亮度与客观数值孔径的平方成正比。

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然而,与显微镜照明系统的情况不同,客观放大率在确定图像亮度方面也起着重要作用。实际上,图像亮度与横向倍率的平方成反比:


图像亮度α(NA / M)2

其中NA是客观数值孔径,M是放大率。上述等式中给出的比率表示透射照明中物镜的聚光能力(注意:落射照明的情况稍有不同,如下所述)。表1中列出了具有不同程度光学校正的选定物镜的聚光能力的例子。一般而言,具有高数值孔径的物镜也可更好地校正像差。因此,对于相同的放大倍数,更高的数值孔径物镜可以收集更多光线,产生更亮更好的图像(请参阅表1),并且整体图像更好地解决。


通过检查表1中的数据可以明显看出,在物镜用于透照的情况下,随着具有相同校正的一系列物镜中的放大率增加,图像亮度快速下降。相反,使用类似的落射照明系列物镜会产生越来越明亮的图像,因为放大倍率会通过较低的范围(10x到40x)增加,但在较高的放大倍数下往往会降低。同样显而易见的是物镜趋势是在最高数值孔径值下在落射照明(而不是透射照射)中产生更明亮的图像。


表1中使用的术语F(反式)和F(epi)是指物镜的聚光能力,并且根据以下等式计算:


F(trans)= 104·NA2 / M2


F(epi)= 104·(NA2 / M)2


理论上,照明强度取决于聚光器数值孔径的平方和光源图像缩小的平方(实际上,根据平方律,随着光圈图像变小,场光阑图像变亮)。结果是样本图像的亮度与到达目镜(或相机系统)的物镜数值孔径的平方成正比,并且与物镜放大率成反比。因此,在检查透射光中的样本时,不改变聚光器而改变物镜会响应数值孔径和放大率的变化而影响图像亮度。

Light-Gathering Power of Selected Objectives
CorrectionMagnificationNumerical
Aperture
F(trans)F(epi)
Plan Achromat10x0.256.250.39
Plan Fluorite10x0.309.000.81
Plan Apo10x0.4520.24.10
Plan Achromat20x0.404.000.64
Plan Fluorite20x0.506.251.56
Plan Apo20x0.7514.07.90
Plan Achromat40x0.652.641.11
Plan Fluorite40x0.753.521.98
Plan Apo40x (oil)1.3011.018.0
Plan Fluorite60x0.852.011.45
Plan Apo60x (oil)1.405.410.6
Plan Apo100x (oil)1.401.963.84
Plan Apo100x (oil)1.452.104.42
Plan Apo100x (oil)1.652.727.41

表格1

在落射照明的情况下,除了物镜还起到聚光器的作用外,同样的考虑也适用,并且在考虑图像亮度时必须考虑到这一点。随着客观放大率的增加,光源图像被缩小(缩小)等量,从而导致与客观倍率更小依赖的亮度级别,并且更依赖于数值孔径(亮度由数值孔径的四次幂来控制落射照明)。实际上,由于客观的后部光圈大小差异,图像亮度数字会有所不同(请参阅表1)。


当光照水平有限时,应采用最高数值孔径物镜,但物镜和目镜的放大倍率应保持在与所需分辨率兼容的最低水平。在许多情况下,制造商现在提供具有较高数值孔径的油浸物镜,并且相应地具有较高的图像亮度值,而相比于具有类似放大率的高干物体。例如,表1中的40倍平面复消色差浸没物镜具有平面消色差40倍干物镜的数值孔径的两倍,并且产生透射光中图像亮度的四倍。这些物镜在落射荧光照明下的图像亮度上产生16倍的差异,高数值孔径油浸式产生最明亮的图像。图2给出了低和高数值孔径物镜之间的光锥尺寸的相对差异的比较。请注意,较高数值孔径物镜具有更大的光锥,更大的内部透镜元件,并且能够从具有较低数值孔径的物镜收集比样品多得多的光。

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作为入射强度的函数,透过显微镜光学部件的光量在荧光显微镜中尤为关键。在高分辨率荧光成像需要高放大率且图像亮度损失最小的情况下,应使用具有最大光透射度的最高数值孔径物镜。如上所述,随着放大倍数的增加,总体图像亮度会迅速下降,因此应仔细选择荧光显微镜的组件以最大限度地提高通过光学系统的光量。

如上所述,利用落射照明的荧光显微镜配备有能够兼顾聚光镜和物镜的双重目的的物镜。穿过激发滤光片并从滤光片立方体中的二色镜表面反射的光首先穿过物镜以形成激发样品所需的倒置的照明锥。由附着在样品上的荧光团发出的二次荧光然后被相同的物镜系统收集,并在投影到目镜或成像系统中之前通过二色镜和屏障过滤器。作为聚光器的高数值孔径物镜将以与数值孔径的平方成比例的方式增加信号(光)强度。由于物镜的聚光功率也与数值孔径平方成正比,所以图像亮度将根据以下等式作为客观数值孔径的四次方变化:


图像亮度(荧光)αNA4 / M2

请注意,在荧光显微镜中,亮度也与客观放大倍数成反比。因此,对于相同放大倍数的物镜,照明场和荧光图像的图像亮度随着客观数值孔径而显着增加,这是制造商为荧光显微镜产生具有非常高数值孔径的物镜的主要原因。


用于观察样本的目镜进一步放大投影到显微镜中间图像平面上的衍射极限图像,并且还用于降低样本的整体观察强度。实际上,图像亮度与目镜放大倍数的平方成反比,需要使用具有可能的最低放大倍率的目镜以方便观察试样荧光。因此,通过使用耦合到最低功率目镜的最高可用数值孔径物镜(尽管最常使用10x目镜),可以使荧光显微镜中的图像亮度最大化。这些评论主要适用于具有均匀照度的大型标本区域。在尖锐聚焦点光源(例如微小荧光球)的情况下,粒子图像应该是衍射极限的,并且具有与放大率无关的尺寸。


增加样本信号


在荧光显微镜中,图像亮度由照明强度,荧光团的量子产率以及显微镜的聚光能力决定。照明强度越大,量子产率越高,荧光信号越大,图像越亮,直到所有荧光团饱和。同样在偏振光下,图像亮度由样本的照明强度和双折射延迟决定。在高达延迟四分之一波长的值处,较大的延迟产生较大的双折射,并因此产生较强的信号。

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在这两种情况下,图像亮度都由来自样本的信号控制,这是照明强度与样本引入的光线变化的乘积。在发光的情况下,样品自身发光的情况下,图像亮度明显受样品发出的光线或信号的影响。


这个概念分别在图3和4中对荧光和偏振光样本进行了说明。图3中显示了一对来自夹物叶片薄片的数字图像,其在配备有荧光照明器的立体显微镜上的落射照明条件下拍摄。当使用带通范围在450和490纳米之间的Endow绿色荧光蛋白(GFP)滤光片组激发薄切片时,样品表现出弱的绿色自发荧光(图3(a)),在部分标本,但其他人很弱。相比之下,用较长波长带通滤光片组(530-560纳米;图3(b))激发样品产生明亮的红色自发荧光,在整个薄切片中具有更强的信号。


如图4所示,偏振光显微镜观察到类似的情况。样品是抛光的30微米长的斜长岩,一个几乎完全由长石组成的火成岩。当高度定向的双折射薄片的光轴垂直于偏光片时,通过分析仪的光(信号)被最小化(图4(a))。但是,当光轴相对于分析仪和偏振器以45度角定向时(图4(b)),目镜或图像传感器会接收到最大光量。

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在其他显微镜模式中,如相衬,微分干涉对比(DIC),暗场,霍夫曼调制对比等,照明强度和图像对比度可以独立变化。尽管如此,来自图像的信号,即光学参数的每单位变化(例如,路径长度的差异)中图像亮度的增量,仍将由照明强度与每次产生的对比度的乘积确定光学参数的单位变化。为了检测任何光学参数的微小变化,显微镜应该使该特定参数变化引起的信号最大化。


光透过显微镜


对于给定的聚光镜和物镜数值孔径,放大倍率和照明器亮度,显微镜产生的图像亮度仍可能因光通过光学元件的光线传输而有所不同。光透射取决于几个因素,包括透镜元件和胶合剂的吸收,光学界面处的反射损失以及灯套,漫射屏,滤光片,偏振器和其他辅助光学元件的透射率。图1说明了选定的一组高数值孔径物镜的典型透射曲线。这些数值或多或少地代表了特定制造商的任何一类物镜,但即使在测量这些曲线的特定类型中,透射率值可以根据例如抗反射涂层和单个镜片中使用的玻璃批次而稍微变化。


如图1所示,即使在可见光范围内,一些光学元件的透射率(作为入射强度的百分比透射的强度)也可以是波长相关的。而且,在可见光范围之外的波长处,透镜,棱镜,透镜的透射率,试样的安装介质会明显下降。这一事实由图1中所示的20倍平场荧光物镜透射曲线来例证,其显示随着波长在400和700纳米之间增加,透射率稳定降低。该系列中的其他物镜没有表现出如此明显程度的波长依赖性。


目前已经开发了200多种光学玻璃配方,并且可供光学设计师使用,用于结合到显微镜镜片,反射镜,滤光片和分束器中。通常会仔细选择这些玻璃的性能,例如折射率,色散,透射率,污染物,自发荧光的可能性,化学和热阻以及整体均匀性,以确保最大的光学性能。但是,这些因素往往会影响其他要求,例如近紫外范围内的高透射率或偏振显微镜中的高消光因子。一些新材料,例如氟代聚合物玻璃,能够接近天然萤石的特性,同时避免其大部分缺点,如有机污染物和结晶微结构的存在,这会严重降低荧光和偏光显微镜的性能。然而,完全复消色差校正仍需要天然萤石和在近紫外范围内透射率降低的玻璃。理想的折衷方案通常是半复消色差或萤石物镜,这是一个真正的多用途物镜,具有良好的对比度,高数值孔径值和高光谱吞吐量。


尽管光学胶结物厚度平均仅为约10微米或更小,但置于双重或多重透镜元件之间的胶结物可具有光谱吸收特性,这可能使得物镜不适用于特定应用。在大多数情况下,光学眼镜和一些光学胶的化学和光学特性通常是专有的。

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即使在没有光吸收的情况下,玻璃 - 空气界面处的所有表面都会反射一些光线并导致透射损失,并且光束正常入射到界面。随着入射角增大,反射和透射损耗以取决于光波振动方向(垂直或平行于入射平面)的方向的方式增加。每个未涂层的空气 - 玻璃界面可以反射垂直于表面入射的光束的4%到5%(见图5)。正常入射时,每通过未处理界面的透射率因此将为95%至96%。通过使用抗反射涂层(通常是具有合适折射率的四分之一波长厚的干涉膜),对于中等波长范围的波长和入射角,玻璃表面的光反射可降至1%或更低,如图5所示对于400和850纳米之间的波长范围。


已经开发了多层抗反射涂层,它可以将空气 - 玻璃界面处的反射减少到在更广泛的波长范围内低至0.1%的值。大多数常用的多层干涉涂层具有略带绿色的色调,与单层涂层的紫色相比,使其更容易识别。一些抗反射涂层,特别是多层抗反射涂层,对于非法向入射波表现出各向异性,并且可以极大地降低偏振相关光学系统中的消光因子。


随着客观复杂程度的提高,需要更多的镜头元件,并且这突出了消除内部反射以产生更高的传输,更好的对比度以及更少的闪光的需要。这些特性对于入射或反射光应用尤其重要。可追溯到20世纪40年代的单层减反射涂层已由多层涂层进行改进和补充,通过空气 - 玻璃界面将可见光谱范围内的透射率从约96%(未涂覆)增加到接近99.9%(使用多层涂层,如上所述并在图4和5中示出)。图6示出了折射率为1.5和1.8的玻璃表面上的多次反射效应(分别为上图和下图)。在较低的折射率(1.5)下,具有其16个表面的八个元件(每个反射大约百分之四的入射光)导致仅仅百分之52的吞吐量。相反,较高折射率玻璃元件(1.8),16个未涂覆表面将仅通过26%的入射光。单层抗反射涂层将透射率提高到85%,而多层涂层将此值增加到约94.6%。这种吞吐量的增加和内部散射和噪声的相应减少大大增强了图像的对比度,因为它使明亮特征更明亮,黑暗特征更暗。

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涂层材料是氟化镁或许多专有材料,所有材料都有其自身的光学特性,可能影响光学系统在给定光谱区域的透射。通常,抗反射涂层的干涉特性受光谱限制,对于可见光范围内的高透射率的相长干涉意味着在透射带外谐波相关频率上的相消干涉。


大多数现代高数值孔径物镜具有高度的光学像差校正,包含多达15个单独的透镜元件和多达10-12个空气 - 玻璃界面。如果镜片没有涂层,单独的轴向射线的反射损失会使这些物镜的透射率下降到约50%。使用单层或多层干涉膜涂覆所有表面,透光率可提高到约86%至90%。


除了物镜中发现的这些透镜元件之外,现代显微镜的光学系列中可能存在两到四十个玻璃 - 空气界面:


Lamphouse和收藏家 - 4-6个人镜头元素

内部光学火车 - 2-8个镜子,棱镜和中继镜

过滤器 - 2-8个单位的透射或落射荧光

分光镜 - 观察管和相机系统中的1-4个单元

聚光镜 - 4-8个镜头,取决于光学校正

标本 - 0-4包括幻灯片和盖玻片

目镜 - 4-6取决于光学校正和设计

相机系统 - 2-6个镜头,镜子和滤镜元件

在极端情况下,包含物镜时可以有多达五十个光接口。少于9%的轴向射线将通过具有60个未涂覆界面的显微镜传输,并且所有表面都涂覆超过50%。


高品质的镜片涂层不仅对改善光通过显微镜的透射率,而且对于减少由于玻璃表面的多次反射引起的闪光都是必不可少的。但是,即使是最好的涂料也不会超过一定的波长范围。对于某些波长,涂层甚至可以增加反射率(半波干涉膜是理想的反射器)。对于使用CCD相机,光电二极管,光电倍增管或视频传感器的数字成像来说,这是一个需要牢记的重点,光电探测器的灵敏度可以在非常远离人眼的波长处达到峰值。


除了光学接口处的反射损失之外,通过灯罩的光传输阻塞可能会降低图像亮度。随着灯老化,玻璃或石英夹克可能会因为它从灯丝或电极蒸发的雾化金属失透或变得涂层或渗透而变得开裂或变暗。值得注意的是,灯罩的透光率在紫外线下可能比可见光区域下降得更快。在这种情况下,用光度计测量的可见亮度或亮度可能是汞或氙弧灯的紫外线输出的较差指示器。


一个磨砂玻璃扩散屏幕只能传输百分之十到十五的光线,在其正常的3%内传播。更少的光线以斜入射角度传输。因此,只要照明水平必须最大化,应该避免磨砂玻璃扩散器。


随着通带变窄,滤光片和二色镜的传输会下降。许多干涉滤光片仅在波长处传输15%至30%的入射能量用于峰值传输。但是,一些半传输带宽窄至50埃的多层干涉滤光片可以提供75%或更高的峰值透射率。

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用于偏振和差分干涉对比(DIC)光学器件的偏振滤光片也可以显着减少通过显微镜的光透射。即使当偏振器和分析仪轴在峰值透射率下被设置为平行位置时,每个具有20%的自然光透射率的偏振滤光器组的透射率仅为约8%。相反,具有防反射涂层的盖板的高质量方解石棱镜可以传输每对约50%的入射非偏振光的理论最大值。


图7展示了现代光学显微镜中的内部透镜元件,用于透射光和反射光的照明和观察。请注意灯和场镜之间显微镜基座中存在的大量玻璃 - 空气界面,以及垂直照明器中的类似数字。窗户中还有大量的接口,观察管和目镜的棱镜和透镜,以及喷嘴和聚光镜组件。


如上所述,多种因素可以限制通过现代显微镜的许多光学部件的光透射。在追求最高分辨率的地方,特别是在图像本身暗淡的对比增强模式下,应该仔细检查之前列出的所有因素。应该重申,整个显微镜的透射率取决于所有光学元件的透射率的乘积。


照明亮度


在配备有良好校正的照明器(包括收集器透镜系统)和聚光透镜的显微镜中,科勒照明条件下场的照度(照度)受多种因素控制,包括固有亮度(平均发光度密度)和用于光源的聚光透镜的焦距。另外,聚光透镜系统的数值孔径,聚光器孔径光阑光圈开口尺寸的设置以及照明系统的整体透射率有助于控制照明度。


在科勒照明下,从光源上的每个点发出的光均匀照射显微镜视场光阑,以产生明亮且均匀分布的照明场(取决于光源的性质)。因此,视场光阑开口的大小仅影响照明场的直径而不影响其亮度。

Luminous Density of Selected Light Sources
LampCurrent
(Amperes)
Luminous 
Flux
(Lumens)
Mean Luminous
Density (cd/mm2)
Arc Size
(H × W)
(Millimeters)
Mercury Arc
(100 Watt)
5220017000.25 × 0.25
Xenon Arc
(75 Watt)
5.48504000.25 × 0.50
Xenon Arc
(500 Watt)
30900035000.30 × 0.30
Tungsten-Halogen82800454.2 × 2.3
表格 2

假设聚光透镜的焦距不会太短,以致不能覆盖整个聚光透镜光圈开口的光源图像,则聚光能力或透镜的f值(直径/焦距)不会影响场的照度。光源的平均发光密度和聚光器数值孔径的平方确定场的照度,只要聚光镜光圈开口充满光源图像即可。只有当光源的图像没有覆盖整个聚光器光圈时,会聚透镜的聚光能力和光源的大小才会影响现场照度。


总之,平均发光密度(光源每单位面积的光输出)决定了图像亮度,而不是总光输出,光通量或光源面积。来自光源的光通量是发光密度与光源面积的乘积,后者在确定平均发光密度时只扮演次要角色。由于光源的发光密度限制了场照度,图像的亮度决不会超过光源的发光密度。换句话说,无论在光学系统中采用何种巧妙的反射镜,棱镜,透镜或其他组件的巧妙布置和组合,该场永远不会比光源更亮。表2列出了几种具有相对较高发光密度的照明光源,可用于光学显微镜,并包括诸如光通量,电弧尺寸和平均发光密度等规格。


应该指出的是,许多集中式弧光灯(汞和氙)提供非常高的发光密度,并且在弧上具有非常不均匀的光分布度。通常,即使在整体尺寸很小(低至0.3×0.3毫米)的弧内,电弧在与其中一个电极相邻的一个微小点中最亮。当这种电弧的图像被投射到聚光器孔径中时,不再具有均匀的照明强度分布。因此,标本中每个点产生的衍射图样都偏离理想的艾里斑。尽管如此,由于高平均发光密度,这些弧光灯对于显微镜中的某些应用(主要是荧光)是必不可少的。针对这种情况的一种补救措施是使用单根光纤(不是光纤束)光扰频器,该光纤扰频器可以添加到显微镜中而不会明显损失平均照度。图8示出了在由于照明强度的不均匀分布导致场照明不均匀的情况下在物镜后焦平面处的荧光图像。在图8(a)中,样本图像被均匀照亮,并将可接受的图像投射到传感器上。相反,在图8(b)中,试样在视场上没有被正确照射,并且会导致强度波动明显的图像。

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显微镜下位聚光镜是决定提供给样品照明质量和程度的关键因素。一些显微镜聚光镜可以在聚光镜顶部透镜和物镜前部透镜之间使用,也可以不使用浸没介质。更经常地,更高质量的聚光镜被设计为与具有特定折射率和色散的特定浸入介质一起使用。介质可以是油,甘油,水或空气,填充聚光镜顶部透镜元件和载玻片下表面之间的空间。


大部分暗场和一些相位差,差分干涉对比(DIC)和偏振光学光学器件都需要将聚光器浸入,以获得高聚光镜数值孔径。当使用具有确定折射率和色散的正确浸入介质时,聚光镜被设计用于最佳性能和最小像差。浸入消除了超过临界角的光损失,消除了额外的折射,最大限度地减少了光的反射损失,并且减少了可以在高入射角度下散射或反射光的光学界面的数量。这种散射和反射成为耀斑的来源,并且也改变了偏振光的状态,从而减少了高数值孔径偏振光学系统中的消光。总之,聚光镜的浸入会影响现场照度以及图像的质量。为达到最佳性能,设计成浸入式的聚光镜应浸入正确的介质中。


尽管场的照度随着聚光器数值孔径的平方而增加,但是将聚光镜虹膜光圈打开得太远超出匹配的物镜数值孔径会产生耀斑。此外,未照射物镜光圈的照明部分产生叠加在明场图像上的暗视野图像,从而降低图像对比度。


结论


如上所述,在光学显微镜中曝光在视频传感器或照相胶片平面上的区域与放大倍数的平方成比例。因此,图像亮度随着放大倍数的平方而下降。一般而言,显微镜被用来暴露样本中的细节,但同时,显微镜是一种有效的光收集仪器。正如望远镜或双筒望远镜在夜间改善我们的视野一样,显微镜的聚光能力可以有效地用于捕捉微弱照明物体的图像。


取决于必须可视化的样本的特征,如果收集更多光线而不是提高放大率,则图像可能变得更有意义。对于许多发光和荧光标本,光照水平可能太低,以致高倍放大的图像变得不可见或不可检测,因此完全没有意义。在这种情况下,通过随着时间的推移(如果样本是静态的)对光进行积分,或者通过减小图像的放大率来收集更多的光,可以使图像变得更易理解。


对于极低光照条件下的情况,可以通过使用最低整体放大倍数下的最高数值孔径物镜来最大化图像亮度。在某些情况下,使用目镜减少而不是增加中间图像的放大倍数甚至是有益的。


为了使传感器分辨率与物镜的分辨能力相匹配,总体趋势是提高投影到CCD传感器或视频拾取设备上的图像的放大倍率。由于图像亮度下降了放大倍数的平方,并且传感器只能在有限的强度范围内运行,因此增加放大倍数可能导致亮度下降到传感器的灵敏度以下。如果样本静止不动或变化非常缓慢,则可以通过在几个帧时间内对图像进行积分,通过对信号进行求和或平均,或者更好地将光电子集成到传感器本身中,从而显着提高信噪比。在这种情况下,牺牲时间分辨率来改善空间信息。无论如何,在尝试提高分辨率和尝试降低噪声级别之间经常会出现拔河比赛和妥协,而噪声级随着图像变暗而急剧上升。当图像亮度有限时,显微镜专家必须仔细微调仪器放大倍数以达到最佳平衡。


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