激光共聚焦显微镜样品制备方法:组织切片样品

2018-08-17 16:52:55 普赫 1227


应用激光共聚焦显微镜技术对荧光标记的组织切片样品进行三维观察成像是生物学研究的常规手段。本文主要介绍实验室制备用于激光共聚焦显微镜成像的冷冻组织切片及免疫荧光标记过程。


应用于激光共聚焦显微镜的组织切片样品多采用冷冻组织切片,可尽量保持组织样品的抗原活性 。 组织采集后 ,经固定、冷冻包埋、冷冻切片、晾片,进行免疫荧光抗体标记。

 

组织的采集、固定和保存

 

不同来源的组织可依据实验条件和实验目的而采用不同的固定和保存方法。实验室通常采用液氮冷冻法和多聚甲醛( PFA) 固定法。

液氮冷冻法:采取新鲜组织后,即可放入液氮中保存。

多聚甲醛固定法:小鼠、大鼠等实验动物经生理盐水和 4% PFA 灌流,采取组织,组织块尽量小于1cm ×1cm ×1cm,置于4% PFA 中进行后固定,后固定的时间可根据组织块的大小和致密程度而调整,可以 4 ℃固定过夜,或室温1~4h。之后,用0.01mol /LPBS缓冲液洗 3 次,每次10~30min 。在20%  糖中℃ 浸泡1h 以上,待组织块下沉后,即可进行冷冻切片。组织块可置于℃ 冰箱保存于20% 蔗糖 0. 05% NaN3) 中,一个月内完成切片。表达荧光蛋白的实验动物组织,可遵循以上方法处理样品。有些组织样品,如小型实验动物胚胎以及需同时采集样品进行 DNA 、蛋白质提取时,可根据实验情况和条件采集新鲜组织,直接进行化学试剂固定。实验室通常配制10% PFA 储液,称取 10g 多聚甲醛 ( SIGMAProduce No. : P6148 ) 粉末,置 250 mL 锥形瓶中,加入80 mL0. 01 mol / LPBS,再加入5~610NNaOH,于65水浴中溶解3~4h,待完全溶解后冷却至室温,调 pH 值至 7.4,溶液定容至 100 mL,过滤后分装成每管 4 mL  8 mL,保存于 - 20 ℃ 。使用前将储液置于 80 ℃ 水浴中融化,用0.01mol/LPBS稀释至4%,即可使用。(4%PFA工作液配好后可以4密闭保存,24h内使用。)

组织的冷冻包埋和切片

组织的冷冻方法可根据固定和保存条件不同而不同,尽可能加快冷冻速度以力求减少组织在冷冻    冰晶    。组织冷冻后 ,使用冷冻切片机,将组织切成 5 ~ 15 μ的切片,粘贴于处理过的载玻片上,室温干燥 1h 后,可进行免疫荧光抗体标记。或放入载玻片盒,- 80 密闭保存。

气体CO2 冷冻包埋法:新鲜组织样品块以及经液氮冷冻固定和化学试剂固定的样品块都可采用此方法冷冻。现将组织块放在滤纸上吸取表面液体,放入样品台的冷冻包埋剂(OCT)中,调整样品位置,打开钢瓶开关使压缩 CO2 气体喷出,迅速冷冻组织样品。冷冻后的样品转移至 - 20℃ 冰箱或冷冻切片机中,使样品温度平衡至切片温度(通常冷冻切片机箱体温度设定为 - 20℃ ,也可依据组织致           调整 ) ,即    ,也   置于 - 80℃ 密闭保存,一周内完成切片。

干冰冷冻包埋法:此方法适合小块和致密度低的组织,如实验动物胚胎、小块组织 、活检组织等。将经过 4% PFA 固定及 20% 蔗糖浸泡过的小组织 块放入冷冻包埋模具中,小心去除周围的蔗糖液体 ,调整位置 ( 根据切片方向调整 ,必要时可在体视镜下操作后,置于干冰上临时无干冰,也可置于-80冰箱),待冷冻完全后,将样品移至冷冻切片机  ,温度平衡后,将样品从冷冻包埋模具中取出 ,进行冷冻切片。

液氮冷冻法:成年小鼠和大鼠的脑及稍大一些的组织块也可采用此方法冷冻。将组织块置于样品台的 OCT中,为防止组织块爆裂,先在液氮中迅速浸提几次,时间从1s开始逐渐增加,直至样品温度与液氮温度平衡,之后移至冷冻切片机中,使温度与切片机箱体温度一致,进行冷冻切片。

直接冷冻法:将样品直接粘着在涂有 OCT 的样品台上,于冷冻切片机箱体温度在 -20  以下中直接冷冻。 


冷冻组织切片的免疫荧光标记

将冷冻组织切片从 -80℃ 冰箱中取出,室温放置 10 min,待切片回温并干燥,浸于 PBS  10 min洗去OCT,可以无需 Triton 处理,即可进行免疫荧光抗体标记,操作步骤与培养细胞反应方法相同。反应在避光湿盒中进行,反应结束时用无荧光封固剂封片,4℃保存。先用荧光显微镜观察,确认标记成功,移至激光共聚焦显微镜扫描成像。

 

荧光染料及荧光蛋白

传统应用于荧光标记的染料如异硫氰酸荧光素(fluorescin isothiocyanateFITCex 490 nm/em520 nm)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITCex 550 nm/em 620 nm)、罗丹明(Rhodamineex 560 nm/em 540 ~ 660 nm)、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamineTMRex 570 nm/em 595 ~ 600 nm)、德克萨斯红(Texas redex 592 nm/em610 nm)、氨甲基香豆素(Aminomethylcoumarin acetic acidAMCAex 345nm/em425 nm)等,结合激光共聚焦显微镜技术的发展,这些经典的荧光染料逐渐被层出不穷的新的荧光染料所替代。如 Cyanine 类荧光染料,其中 Cy3(ex554 nm/em568 nm)的激发峰值更接近于新型固体 561 nm 激光器,且比 TRITC 等更亮、更稳定,已 被广为应用于免疫荧光抗体标记;Alexa Fluor 系列荧光染料激发和发射光谱窄,可用于多重荧光标记而更少光谱重叠;ATTO 系列荧光染料具有较强的光稳定性和热稳定性,已被应用于 STED(Stimulated Emission Depletion 受激发射损耗)超高分辨率显微成像技术[;DyLighCF等更多新型荧 光染料系列都将因其较高的激发效率、良好的光稳 定性、宽泛的 PH 稳定性等优越的特性而被广泛的 应用于组织及细胞免疫荧光标记。

组织切片的细胞核标记目前仍然采用 DAPI(46-联脒-2-苯基吲哚,ex 359 nm / em 461 nm),其特点是专一性强、灵敏度高、稳定性好、毒性小,且可被405nm激光器有效地激发,获取明亮的核标记荧光图像。PI(碘化丙啶 ex 536nm / em 617nm)也可以用于核标记,因其可识别 DNA  RNA,核染色前须进行适当的RNA 酶处理。TOTO 系列、YOYO 系列荧光染料也可作为组织细胞核荧光染料。

表达荧光蛋白的组织经冷冻切片制样后,可直接封片,观察并扫描图像,也可配合使用其它荧光染料进行免疫荧光抗体标记和核染色。同时表达GFP  RFP 荧光蛋白的组织切片,如还需作免疫荧光抗体标记,应选择可以被 633 nm  405 nm 波长激光器激发的荧光染料,如 CY5Alexa fluor 633 Alexa fluor405 等。

  

样品制备中相关实验方法

用于免疫荧光抗体标记组织切片的载玻片需经过明胶、蛋白胶、多聚赖氨酸 ( Poly-L-Lysine)、硅烷(3-氨丙基三乙氧基硅烷,APES) 等处理,以粘贴组织切片,防止组织切片在免疫反应过程中脱落。简易明胶处理方法是将干净的载玻片浸于 0.1% 明胶热溶液中一分钟,取出沥干,65 ℃ 烘烤 1h,放至室温即可使用。0. 5% 明胶 - 硫酸铬钾处理方法是溶解4g 明胶和4g 硫酸铬钾于 800 mL d2H2O 中,65加热30 min 左右,使其溶解(不要使溶液沸腾)后,过滤溶液,并将溶液在室温下放置至 50 ℃ 左右,将玻片在溶液中浸提 3~4 次,在室温下过夜使其蒸发干,为防止灰尘,用保鲜膜覆盖,130 ℃ 烤干 3 h 以上,干燥保存备用。处理液使用后,可加入 0. 05% NaN3 ℃ 保存,下次处理载玻片时将溶液加热至50 ℃ 即可。大量处理过的载玻片,可以收集于载玻片盒中,放在干燥箱中长期保存。蛋白胶处理方法简便易行,多用于样品量不多的情况,取新鲜鸡蛋清充分搅拌,℃ 过滤,清液加入等体积无荧光甘油,再加入 0. 05% NaN3 充分混合,分装成每管 1 mL- 20℃ 保存,使用时室温融化,取少量蛋白胶均匀涂抹在干净的载玻片上,40℃烘干,放至室温即可使用。目前国内可以采购到明胶、多聚赖氨酸、硅烷等处理过的载玻片,大大节省了样品制备的准备时间。

免疫荧光抗体标记后需用盖玻片进行组织切片封片,尽量选用 0.13 ~ 0.17μ厚度的盖玻片。Fisher 等公司的盖玻片厚度均匀,透光性好,对于获取效果好的荧光图像非常重要。

对于荧光标记过的样品应该用无荧光封固剂封片,并尽量选择封片后可以凝固的无荧光封固剂,如 Mowiol  4 ~ 88 ( SIGMAProduce No.:81381)。如果临时封片,也可以封于 50% 甘油中,此时应尽量使用最少体积的液体,以减少样品移动。配制 Mowiol 封固剂时,在50mL 离心管中加入 2.4g Mowiol6g 甘油和 6mL去离子水,室温摇摆 2h,使 Mowiol 完全长大透明;再加入12mL 0.2 mol/LTris 溶液(pH8.5)50 摇摆过夜,直至Mowiol 完全溶解;4 000 ~ 5 000 rpm 离心 20 min;分装成每管 1 mL- 20 ℃ 保存。使用时室温融化,通常每个22 mm ×22 mm 组织切片滴加15 ~20 μL,覆盖盖玻片,注意切勿加过量封片剂。封片后,避光放置于室温 4 h 或过夜,待封片剂凝固后,即可在荧光显微镜油镜下观察,进而进行激光共聚焦显微镜图像扫描,以上样品可收集于载玻片盒中 4℃ 保存。

除冷冻组织切片外,其它生物学样品可根据组织特性及实验需求,采取不同的制备技术,进行激光共聚焦观察成像。如微小生物压片、植物压片可以用无荧光封固剂封片,随即观察。新鲜动物组织印片经热固定、荧光标记后,进行观察成像。表达荧光蛋白的小型实验动物整体样品,如果蝇 、斑马鱼、小鼠胚胎、鸡胚、小型组织器官等可以用无荧光封固剂封于有浅层小室的载玻片中,进行光学切片观察和三维成像。石蜡组织切片样品经常规的石 蜡切片、免疫荧光抗体标记,也可进行激光共聚焦 显微镜成像。

Highest performance optics for confocal imaging

A selection ofhigh numerical aperture (NA) objectives are available, which provide chromatic aberration correction for UV to near-infrared.


CFI SR HP Plan Apochromat Lambda S 100XCSil

By using silicone oil that has a refractive index closely matching that of live cells as its immersion liquid, this lens allows high resolution imaging of thick samples and is suitable for long-termtime-lapse imaging.

·Numerical aperture: 1.35

·Chromatic aberration correction: fromvisible to UV

·Nano Crystal Coat applied.


CFI75 Apochromat 25XC W

This lens is suitable for multicolorimaging of living cells.

·Working distance: 2.0 mm

·Numerical aperture: 1.10

·Chromatic aberration correction: fromvisible to near-IR

·Nano Crystal Coat applied.


CFI Apochromat Lambda S 40XC WI

Its high NA for water immersion objectives provides brighter and higher-resolution images and makes this lens ideal for confocal live cell imaging.

·Numerical aperture: 1.25

·Chromatic aberration correction: from UVthrough to near IR

·Nano Crystal Coat applied.


CFI Plan Apochromat VC 60XC WI

This lens’ chromatic aberration correctionup to the UV range enables accurate multicolor confocal imaging.

·Chromatic aberration correction: the fullvisible wavelength range over 405 nm

·Superior image flatness


CFI Apochromat TIRF 60XC Oil

This lens has the industry’s highest NA,providing unparalleled resolution and efficient acquisition of fluorescentsignals in confocal imaging.

·Numerical aperture: 1.49


Nano Crystal Coat for superior transmission

Nikon’s exclusive Nano Crystal Coat is ananti-reflective coating consisting of ultra-fine crystalline particles. Thisforms a coarse structure that enables lower refractive indices, facilitatingthe passage of light through the lens rather than reflecting it, thus providingsuperior light transmission.


Objectives for confocal microscopy

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