奥林巴斯：反射光柯勒照明的应用
在明场反射光学显微镜下，正确使用图1所示的两个可变光阑，孔径光阑光阑（靠近光源）和场光阑（靠近样品），可以使用非常理想的科勒照明。
这些光阑与透射光的各自位置相反，孔径光阑现在更靠近光源。这种照明提供均匀分布在聚焦标本视场平面上的明亮光线。科勒照明提供无眩光光线，利用物镜数值孔径的*大份额与良好的对比度和分辨率保持一致。
重要的是要注意，在这些反射光系统中，物镜具有双重功能：在正确对准的匹配校正好的聚光镜的途中，在作为成像物镜的道路上，成为将图像携带光线投射到目镜的物镜的习惯角色。在透射光系统中，改变物镜需要调整聚光镜的数值孔径以匹配新物镜的数值孔径。但是，在反射光中，物镜和聚光镜的数值孔径会随着新的物镜同时发生变化。共轭平面与所描述的透射光相似，光源的图像形成在物镜的后焦平面内以及孔径光阑的虹膜开口内。这有助于降低建立反射光显微镜科勒照明条件的复杂性。
柯勒照明的功能（除了提供均匀分散的照明），是为了确保物镜能够提供出色的分辨率和良好的对比度，即使光源是线圈灯丝灯。光圈可变光圈控制从明场反射光中的全锥体中的每个方位角照射样本的光的角度。物镜的数值孔径决定了从样品反射时可以“捕获”的光线的角度。其他因素相同，数值孔径越高，物镜的分辨率就越好，即物镜能够更好地清晰地分离彼此靠近的小细节。该系统的垂直照明器包含光圈可变光阑，因此物镜本身的背面不必被遮挡。
在科勒照明系统中，系统布置（图2），使灯的线圈灯丝的图像聚焦在光圈可变光阑的平面上; 它也专注于物镜的后焦面。 假设照明器的光路中没有磨砂滤光片，当目镜被移除时，灯丝的图像可以在物镜的背面看到。 在大多数系统中，灯罩外部有一组对中螺钉（图3），可以使灯丝沿南北或东西方向移动，从而使灯丝居中。 另外，如上所述，孔径可变光阑的关闭或打开可在物镜的后焦面处观察到。
场虹膜光阑与聚焦标本共轭（预聚焦），目镜固定光阑平面上的中间像平面和眼睛视网膜。
反射光显微镜的兴趣越来越大，特别是在荧光显微镜中它越来越有用。快速增长的半导体工业也导致反射光显微镜的使用增加，这在经典应用中仍然非常有用，例如金相学，矿石岩石学和材料研究。
实际上，样品首先用中等放大倍率物镜聚焦，通常为10倍，预聚焦场光阑的光圈关闭，直到它在视场外围可见。如果光圈可变光阑不居中，则使用垂直照明器上的定心螺丝将部分关闭的光圈开口移动到场中心。然后打开光阑，直到它从视图中或从显微摄影掩模版中胶片框所描绘的区域中消失。接下来，灯丝居中并聚焦（如果这尚未在工厂完成），并且孔径光阑设置为*佳样本对比度和图像质量。这些步骤将在下面的部分中详细讨论。
反射光显微镜的调整
为科勒照明
目镜和视场光阑
选择具有高反射率的样品，以便在*初的科勒照明配置步骤中*大限度地反射回物镜的光量。理想的选择是高度反射硅片上的集成电路，高度抛光的金属部分或光滑的金属薄膜。标本应具有一定程度的细节或纹理，可用于找到标本的焦平面。
将反光试样放在舞台上，并启动光源，通常是放置在类似于图3所示的灯壳中的钨卤素灯泡。旋转物镜转换器以将中等功率物镜（例如10x，面对标本。如果灯泡工作正常，物镜将在物体表面投射一个直径约3毫米的小圆圈。
在观察物镜和标本时，使用粗调焦旋钮升起镜台，直到镜头的前镜头下方几毫米。小心不要将标本推入物镜前镜头。接下来，在通过目镜观察样品的同时，缓慢降低平台（首先）粗糙的聚焦旋钮，直到样品细节进入清晰的焦点。如果没有找到焦点，重新从物镜前端镜片和样品之间的距离稍微缩短一点。在许多情况下，如果标本在试图确定焦点时正在移动，则更容易找到正确的焦点。通过旋转360度的圆形舞台或使用机械舞台旋钮在视场中来回移动样品来完成此操作。
一旦标本处于清晰的焦点，调整双目显微镜上的瞳距。每个目镜的屈光度调整也应该在这个时候进行。
许多偏振和差分干涉对比（DIC）显微镜都配备有圆形刻度台，可以围绕显微镜的光轴旋转360度。这些显微镜通常为每个物镜配备单独的调节装置（通过鼻托中的固定螺丝），以使物镜的光轴与显微镜的光轴同心。继续进行此调整是个好主意。
下一步是调整视场光阑，该光阑是距离显微镜前部*近的虹膜光阑，如图4所示。有时光阑直接贴在照明器外壳上标记为“F”或“Field”。使用杠杆调整关闭现场光圈，直到您开始在视场中看到叶片。继续关闭光阑到杆停止的位置，目镜只能看到一个小开口。标本和膜片的叶子应该都是清晰的焦点，这通常是在工厂制造的，因为大多数现代反射光学显微镜不能调节视场光阑的轴向位置（它无法聚焦） 。这是因为该物镜兼具聚光镜的双重作用，所以在出厂时预设了关键焦平面以*小化显微镜对准误差。在大多数情况下，各个物镜的视场膈的焦点和中心之间会有细微的差异，但这种小的波动通常可以忽略不计。
一组定心旋钮位于垂直照明器的外壳上，靠近视场光阑，允许用户将视场光阑对准视场。使用这些旋钮将视场光阑图像居中，然后缓慢地打开虹膜叶片，直到光阑图像刚好位于视场外。如果显微摄影是主要考虑因素，则视场光阑应打开得足够宽，以便可以看到胶片画面中的轮廓区域（刻入显微摄影标线）。改变物镜不需要调整视场光阑尺寸设置，因为新的物镜也将作为聚光镜，并且关系将保持不变。通过将视场光阑关闭到与显微摄影或测量光罩相关的预定尺寸，可以很容易地验证这一点。改变物镜后，视场中图像的大小会改变，但场光栏和标线之间的大小关系不会改变。
灯丝对准和光圈调整
与透射光中的科勒照明一样，调节反射光中的（“聚光器”）孔径光阑对于控制样品对比度，减少衍射和眩光伪像以及产生*佳图像质量至关重要。灯丝的图像应该聚焦并完全填充孔径光阑，类似于透射光的情况。
第一步是对灯丝进行居中和聚焦。一些现代反射光学显微镜（尤其是高端研究型号）在一个外壳中配备了一个预先居中的卤钨灯，该外壳还配有一个聚光镜和一个漫射屏。没有对这些系统进行调整，但许多旧的落射照明系统必须使灯必须居中，并为此提供了调整机制。第一步是去除（如果可能的话）将光照均匀分布在视场上的玻璃扩散滤光片。接下来，使用调节旋钮（参见图3）将灯丝居中，同时观察物镜后焦平面上的共轭图像。这是以类似透射光显微镜的方式完成的，其中目镜被移除并且通过眼管在物镜的后焦平面处观察聚光器孔径和灯丝图像。欢迎访问者和学生在以下交互式Java教程中探索灯丝对齐：
当目镜从眼管上取下时，灯丝（清晰焦距）的图像应该在物镜的后焦平面以及部分闭合的孔径光阑上可见。通过使用相位望远镜，Bertrand透镜（通常在偏振光显微镜上发现的附件）或者通过在中心具有针孔的端帽来促进这种观察。后者可以由在运输过程中用于保护显微镜内部的目镜插头制成。如果没有（或不能）移除磨砂玻璃扩散屏，则应使用均匀照明的光盘代替灯丝线圈。如果灯丝不居中，光盘上会出现“热点”，可以通过调整灯箱上的螺丝来解决（图3）。继续进行增量调整，直到整个光盘上的照明均匀。
*后一步是调节孔径光阑的开口，孔径光阑通常由垂直照明装置外部的字母“A”或单词“孔径”来表示。在透射光显微镜中，每次将不同数值孔径的新物镜插入光路时，必须重新调整聚光器孔径光阑。这是由于物镜和聚光镜是分开的实体，改变客观数值孔径不会影响聚光镜。为了补偿，必须打开或关闭聚光器孔径光阑，以提供与物镜的数值孔径相匹配的照明锥形光束。然而，在反射光学显微镜中，物镜还充当聚光镜（如上所述，提供照明和成像光路径），并且当选择新物镜时数值孔径相应地改变。
确定孔径光阑的正确设置对获得没有衍射伪影，具有足够对比度并具有*高质量的图像至关重要。通常，这是由折衷和折射造成的*大化图像对比度而不引入错误伪影之间达成折衷的折衷结果。如上所述，孔径光阑必须通过透射光显微镜中的每个物镜变化来重置。然而，在反射光学显微镜中，物镜和“聚光器”随着数值孔径的增量同时变化，并且可以为孔径光阑选择单个设置。该设置通常在60％至95％之间打开，但会因样本而异，并且将严重依赖于样本的反射率。高反光标本需要较小的光圈以减少眩光并增强对比度，但*好根据具体情况进行。*好的方法是首先将光圈打开到*宽的位置，然后在观察样品的同时缓慢关闭光圈以优化对比度。在显微摄影中，“包围”一组显微照片通常是明智的，每组显微照片的光圈大小略有不同。
上述用于明场反射光显微镜的技术也适用于配备交叉偏振，荧光和差分干涉对比（DIC）的显微镜。事实上，在任何这些模式下，显微镜都可以针对科勒照明进行调整，而且通常对比度增强功能可以互换，而无需重新调整显微镜照明。
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查看原始的英语文章：Köhler Illumination in Reflected Light