何为相差显微镜

2019-02-22 10:24:54 普赫 954

在细胞房的同学们,相差显微镜天天见,然而你真的了解ta?

大家看到的相差显微镜是这样的:

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通过ta看到的细胞是这样的:

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细胞你肿么了?化妆了咩?

--喂喂,本胞胞是你们用相差模式观察到的好吗TAT

今天,让我们科普一下何为相差显微镜

光波三要素:频率,代表光的波长或颜色;振幅,代表光的强度;相位,代表波的相对位移。

光在穿过非真空的介质时,会发生振幅和相位的改变。其中,振幅的改变取决于介质对于光的吸收和散射,通常与光的波长,也就是颜色有关。成像设备和人类的肉眼只能感受到振幅的变化。对于透明的生物细胞样本,光在透过样本后,振幅基本无变化,因此肉眼很难观察到。

相位的改变包含很重要的信息,但是不能被直接观察到。

相差显微镜出现之前,人们要观察透明细胞时,需要对细胞进行染色,才能被观察到。这就需要特殊的染色操作,并且细胞也会死亡。相差显微镜就可以观察未经染色的透明细胞,可以保持细胞形态和特征。

相差成像技术在1953年获得了诺贝尔奖,所以,应用相差技术的相差显微镜也算是星二代啦~

环形照明光(绿色)通过聚光镜聚焦到样本,部分光被样本散射(黄色),其余的光没有变化,穿过样本形成背景(红色)。

当样本没有染色时,散射光会很弱,而且通常与背景光有-90度的相位差。此时前向光与背景透射光强度非常接近,因此反差很小,不易观察。

在相差显微镜中,物镜后方会有一个相差环,使样本的散射光产生-90度相位变化,与散射光和背景光同向,从而增大前向光与背景光反差。

通过第二个灰度滤光片,使散射光和背景光都有一定程度降低,由于背景光降低的程度比散射光降低程度大,因此前向光与背景光反差进一步增大,更容易被观察到。

以上是负相差,前向光比背景光强,视野内样本成像比周围背景亮。

目前相差显微镜通常采用正相差。正相差与负相差相反,是使背景光产生-90度相位变化,背景光与散射光方向相反,前向光比背景光暗,样本细节成像更明显。

倒置显微镜常配置相差成像技术,用于透明的生物细胞观察。相差成像对细胞容器没有特殊要求,塑料培养皿即可,便于培养细胞的连续观察。

相差成像技术中,样本周围会产生“光晕”,尤其是在比较大的颗粒如整个细胞周围,使图像产生混乱。但“光晕”也可以增强样本与背景的差异,尤其是增强薄的边缘的细节反差。



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