奥林巴斯荧光显微镜基本知识

2019-01-09 16:20:32 Pooher Inc. 267

与基于宏观样本特征(诸如相位梯度,光吸收和双折射)的其他光学显微镜模式相比,荧光显微镜能够仅基于荧光发射的属性成像单个分子物质的分布。因此,使用荧光显微镜,可以监测用特定荧光团标记的细胞内成分的精确位置,以及它们相关的扩散系数,转运特性以及与其他生物分子的相互作用。此外,荧光对局部环境变量的显着反应使得能够研究活细胞和组织中的pH,粘度,折射率,离子浓度,膜电位和溶剂极性。

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最早的荧光显微镜配置具有经典的明场或暗场透射(透射光)光学系统,其将激发光通过滤光器聚焦到样品平面上。通过物镜收集荧光发射以及大量的激发照射,并通过第二滤光器投射到目镜光阑中以形成中间图像。由于激发光的强度通常比荧光发射大几个数量级,所以这些早期透射光显微镜中的样本视图通常非常低,并且叠加在散射激发照明的背景上。使用高数值孔径油浸式暗场聚光器在高度倾斜的方位角照射样品有助于消除大部分背景噪声,但对除最低数值孔径物镜之外的任何物体均无法提供足够的照明。由此产生的图像分辨率较差,亮度级别很低。

荧光显微镜与入射(反射光或episcopic)照明最初是在20世纪20年代后期开发的,以观察不透明冶金标本中的荧光发射。像他们的明视野对应物一样,这些反射光荧光仪器采用半反射镜分束器,限制在约25%的整体效率(在每次穿过镜面后损失50%的照明强度后)。然而,反射光荧光显微镜具有高数值孔径物镜作为聚光器的优点,并且能够产生比在相似数值孔径下操作的透射光显微镜具有明显更高亮度的图像。此外,反射回物镜(高数值孔径)的杂散激发光仅降低了百分之几。反射光学显微镜的目标的双重作用也显着地减轻了对准的任务。仅仅将物镜聚焦到样品上就建立了照明场和视场,使得入射激发光和观察到的荧光发射遵循通过显微镜光学系统的相同路径。

20世纪30年代中期,当紧凑型汞蒸气和氙弧放电灯被开发出来时,照明源的技术进步为反射光荧光(至少对于金相)的发展提供了支持。在此期间,彩色玻璃和明胶过滤器也变得越来越复杂,这使得使用卤钨灯的蓝色和绿色可见光激发的荧光染料得以应用。20世纪40年代,抗反射涂层和改进的玻璃配方导致了客观设计的重大改进,但对入射光荧光显微镜的发展最根本的贡献是引入了二色分光镜(也称为二向色镜)由俄罗斯光学科学家Eugeny Brumberg于1948年发明。该创新克服了在反射光学显微镜中使用普通半反射镜固有的光损失问题。反射光荧光显微镜在20世纪60年代后期首次由Johan S.Ploem大规模商业化,他在开发Wild-Leitz Ploem Opak方面发挥了重要作用,其中包含多个可互换的光学模块,并安装了各种荧光显微镜滤光片组合。

Epi荧光显微镜的基本策略

反射光荧光显微镜绝大多数是目前广泛应用于非相干光源的研究方法,以及用激光扫描共焦和多光子仪器进行的研究。这种流行的荧光显微镜模式也被称为入射光荧光,episcopic荧光或简单的落射荧光。图1给出了一个典型的现代反射光荧光显微镜,也可用于各种对比度增强模式下的透射光观察。显微镜包含一个三目观察头,与电荷耦合器件(CCD)照相机系统,并且具有两个照明源,一个用于透射光,另一个用于反射镜观察(分别为卤钨灯和汞弧放电)。这种设计的显微镜可以将反射光的荧光与透射光相位对比,微分干涉对比(DIC),偏振光或霍夫曼调制对比观察相结合或交替。

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任何荧光显微镜的基本特征是提供一种机制,用选择性过滤的照明激发样品,然后使用第二个过滤器隔离非常弱的荧光发射,以在最大灵敏度下在暗背景上形成图像。在许多实验中,生物样品中的局部探针浓度很低,只有一小部分激发光被荧光物质吸收。此外,在能够吸收一定量照明的那些荧光团中,发射二次荧光的百分比甚至更低。由此产生的荧光发射亮度水平的范围将比照明小3至6个数量级。从而,荧光显微镜的根本问题是对样品进行高效照明,同时捕获与更强烈的照明带有效分离的微弱荧光发射。这些条件在现代荧光仪器中通过结合基于二向色分束器的作用和性质的激发和发射要求的滤波器的组合而得到满足。

反射光荧光显微镜中的二色分光镜(反射镜)功能背后的原理概述于图2,其中包含在绿色区域(550纳米)激发的荧光团和红色(620-660纳米)波长的荧光团的假设样品可见光谱。高强度光源输出高通量密度(通常覆盖大部分紫外线和整个可见光谱)的宽范围的激发波长,其穿过照射器并首先遇到滤波器,该滤波器选择用于激励的合适波长带标记为EF; 见图2(a))。在这种情况下,滤光片以高效率通过波长在510和560纳米之间的光,但也允许其他波长以小得多的程度通过。激发光下一个到达二色镜(图2中的DM),并被反射到物镜后孔中,形成一个照射的锥体,使样本沐浴。二色反射镜以45度角定位在光路中,并设计成选择性反射波长在490和565纳米之间(如图3所示),同时传输更短和更长的波长。

图3中显示了用于将激发光照与图2中的荧光发射分开的滤光器组合的透射分布图。激发滤光器光谱(红色曲线)表现出510和560纳米之间的高透射率(约80%),其中中心波长(CWL)535纳米。二色镜(黄色曲线)反射激发光谱区域中的波长,同时以较高效率通过较高和较低波长。请注意,二色反射镜曲线上的百分之零透射率对应于100%反射。在490和570纳米之间的透射曲线中的明显的下降(其代表反射峰值)用于反射从激发滤光器以90度角穿过并到达样品上的波长带。光学系统中的最后一个元件是发射或屏障滤光片(白色曲线),透射高于590纳米的波长,这对应于黄色,橙色和红色的可见光。各种叠加光谱的透射波长带和反射波长带之间的边界被设计为尽可能陡峭以确保反射波长和透射波长几乎完全分离。出现在二色镜面光谱中的正弦上升和下降尖峰的模式是薄膜沉积过程的共同效应,称为响了。该滤波器组合的性能卓越,清晰展示了薄膜干涉滤波器技术取得的快速进步。

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因为只有窄带宽的光被二色镜反射,所以设法通过激发滤光片的短于490纳米和长于565纳米的照明波长也透过二色反射镜,如截止点以上的光所示在图2(a)中。请注意,激发光的反射不是100%有效的,因此少量绿光通过二色镜而不被反射。另外,不是所有具有高于565或低于490纳米的波长的光都透过反射镜。这些光中的一小部分被镜子反射穿过物镜并照射到样品上。

由绿光激发产生的样品的荧光发射(主要是红色波长)由物镜聚集并通过二色镜和屏障滤光片(图2(c)中截止点以上的光)。屏障过滤器(标记为BF在图2中)专门设计为仅允许波长大于590纳米的光到达显微镜目镜和/或检测器。在使用这项任务时,屏障滤波器有效地防止激发光波长从样本反射(并成功穿过二色镜)到达检测器。然而,从样品返回的大部分激发波长通过二色反射镜(图2(c)中的截止点以下的光)被反射向激发滤波器和照明器。图2和图3所示的滤波器配置的净效果是将强度明显较高的激发光与较弱的荧光发射分开。在所有情况下,如图所示,荧光显微镜中涉及的滤光片的截止水平不是绝对的,而是使波长范围之外的一些光透过。图2(b)以图形方式显示了整个事件序列,说明了高效反射光荧光显微镜所需的光学路径和战略过滤器布置。

垂直荧光照明器

如图1和图4所示,现代荧光显微镜的核心是通用反射光垂直照明器,该照明器介于观察观察管和携带物镜的物镜之间。照明器设计用于引导由高 - 通过首先将光线通过显微镜物镜向试样方向移动,然后使用相同的物镜捕捉试样发出的光线,从而将光源照射到试样上。这种类型的照明策略有几个优点。显微镜物镜首先作为校正良好的聚光镜起作用,然后收集成像荧光发射以便传输到目镜或相机检测系统。因此,目标始终与这些功能中的每一个正确对齐。此外,样品散射或反射的大部分激发光(360度角以上)从物镜前部透镜元件移开,而不是像透射荧光照明那样直接投射到玻璃中。这种效应被称为正面照明,特别适用于厚的标本。最后,被照明的标本区域被限制在正在观察的同一区域,照明和光线收集都可以利用物镜的全数值孔径。

在垂直照明器的远端是灯箱(参见图4),其包含高强度弧光放电或灯丝基白炽光源。最受欢迎的照明光源是高压100瓦汞弧灯(HBO,通常称为燃烧器),但氙气和金属卤化物弧光灯,激光器和卤化钨白炽灯也可用于此目的。光源发出的光线由收集器透镜系统聚焦,并沿照明器内部平行于桌面并垂直于显微镜光轴行进。图4所示的照明器设计包含一个多分量聚光透镜系统,但非球面透镜元件也正在实施,以改善对近红外和紫外区色差的校正。设计用于消除或抑制红外波长的热过滤器放置在灯箱本身内部或靠近垂直照明器后部的灯箱安装座。另外,一些显微镜包含一个双波段或多波段激励平衡器系统(见图4和8),以选择性地过滤激发不需要的波长,以便微调包含在照明器另一端的荧光滤光器组的性能。

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在垂直照明装置的灯箱附近还有一组中性密度滤光片,可以用来调节通过系统的光的整体强度并减少荧光衰减或光漂白。这些滤光片通常安装在滑块框架上,可以在观察样品荧光的同时快速插入和移除光路。为了建立科勒照明,垂直照明器包含一个中心孔径和视场光阑组合,两者都有可变的光圈孔径,决定了场的大小和照明强度。通过位于垂直照明器外壳每个外侧的几对旋钮完成光圈和视场光阑的对中以及光圈尺寸的调节。在一些设计中,提供了滑块旋钮,该滑块旋钮从光路中移除整个隔膜组件,以最大化通过照明器的光量。其他显微镜包含一个安装在滑块上的固定尺寸的针孔孔径,该滑块可以插入光路中以显着限制照明领域的专业应用,例如光漂白后的荧光恢复(FRAP)调查。

在垂直照明器光学系统中的场和孔径光阑之后是场透镜,这对于散布光并创建用于建立科勒照明的足够照明场是必需的。在现场镜头之后,所有现代化的垂直照明装置都包含一个光闸(手动开关控制),用于在荧光未被观察或记录时阻挡强激发光到达滤光片组和标本。百叶窗是荧光显微镜中的关键特征,因为标本的连续照明可以显着减少由于光漂白引起的发射,而高强度光对活细胞不健康。此外,当使用透射光对样本进行瞬态检查时,快门使弧光放电灯保持活动状态(减轻预热时间)。高端荧光显微镜通常配备电子快门,可快速远程控制照明。一个紫外线防护罩(标记为图4中的呼吸防护罩)安装在照明器外壳的前部,以防止操作员在快门打开时发生潜在危险的短波紫外线辐射的无意泄漏。通过在观察时保护标本不受呼出气体的影响,盾牌也起到双重作用。

几种垂直照明器设计为矩形偏光镜框架提供了一个槽,可用于荧光偏振调查。在大多数情况下,偏光镜插入场镜后面的照明光路(远离共轭平面),但在光闸之前(见图4)。偏振器可以用预定的传输方位固定到位,或者安装在齿轮组上,允许通过使用指轮来改变透射轴的方向。由于偏光片安装在滑动框架中,因此在不使用时可轻松将其从光路中移除。配套的分析仪(荧光各向异性测量所需的第二个偏振器)可安装在滤光片转台上方的垂直照明器中,或者在专门设计的用于偏光显微镜的中间管中。辅助管通常能够插入刻度旋转的偏振器单元,以确保分析仪透射方位相对于偏振器和显微镜光轴的精确定位。

垂直照明器的最后一级包含一个旋转转台或滑动支架,其中放置了包含荧光滤光片组合的光学模块。当需要使用特定的荧光滤光片组合进行成像时,滤光片块被旋转(或滑动)到光学系列中。独立模块包含一组匹配的激发和发射滤光片以及一个二色分光镜,所有这些都经过精心定位,以最大化样品照明并捕获特定波长的荧光发射。光学转台和滑块支架可以在三个和六个单独的块之间进行加载,其中一个位于光路中,其他块则在临时存储中旋转或滑出。当观察用两个或更多荧光探针标记的样本时,这些附件能够在荧光滤光片组之间快速切换。配备有荧光照明器的显微镜中的透射照明的使用通过装配在转台或滑动架支架上的插槽中的虚拟光学块来促进。虚拟块阻止激发发射(当快门打开时),但不包含任何滤光片,并允许光从物镜无阻碍地通过观测管。

在标准模块化立式显微镜中,垂直照明器位于显微镜框架和观察管之间(见图1)。许多制造商提供可插入照明器和目镜单元之间的中间管,用于偏振器,DIC棱镜或其他附件。现代显微镜镜架通常是计算机辅助设计工作的结果,可显着减少振动并增强人体工程学特性。合成材料(如金属基质陶瓷和铝复合材料)显着提高了框架的静态和热刚性,从而使仪器能够承受严格的高级荧光技术,这些技术需要在长时间内完全消除振动用于成像弱荧光发射。

荧光显微镜中的科勒照明

在荧光垂直照明器中,光源的位置应使灯丝或电弧放电等离子球位于聚光透镜主焦点附近。在科勒照明中,灯聚光透镜具有显着放大的二次光源的功能,可增强整体照明。克勒照明的主要要求是,灯丝或电弧的图像必须最终投射到物镜的后焦平面上,在反射光照明的激励过程中,该物镜也会加倍(通常为高数值孔径)聚光镜。光源应理想地填充整个物镜孔径,以使辐射强度最大化并产生均匀照明的场。在某些情况下,热点)。但是,由于扩散滤光片还会降低照度,因此应尽可能避免。

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在反射光科勒照明(图5中示意性地示出)中,光源的图像被收集器透镜聚焦到位于垂直照明器中的孔径可变光阑上。该光阑与物镜的后孔和灯电弧或灯丝共享一个共轭平面,因此决定了照明场的孔径大小。光源,垂直照明器孔径光阑和物镜后焦平面(瞳孔)一起形成共轭平面的照明组。与透射光显微镜的情况不同,孔径光阑和光源成像在物镜(充当冷凝器)后孔径平面上,而不是物理上位于该位置。作为这种配置的另一个好处,当物镜提供激发照明或从聚集的荧光发射形成图像时,所有障碍物(如虹膜光阑)都会从光路中移除。打开或关闭孔径光阑用于控制杂散光并调节照明强度(数值孔径),而不改变照明场的大小。在图像中,孔径光阑的调整会影响亮度和对比度。

反射光科勒照明中共轭平面的成像或场集由场光栏,样本表面和中间图像平面组成。因此,当视场光阑被放置在样本平面的焦点处时,光源的图像被明显地从焦点移除,以便提供均匀的照明场。视场光阑控制照明场的大小,而不影响被观察区域的照明强度。在实践中,视场光阑的开口尺寸应尽可能小,以便增加图像对比度并减少不直接观察区域的光漂白程度。尽管大多数电弧放电和灯丝基光源产生不均匀的照明强度,但柯勒照明仍能使试样场照明均匀。当显微镜正确配置后,物镜的后焦平面被完全照亮,从而提供从边缘到边缘均匀明亮的场。在理想的情况下,科勒照明将会聚一组波前,从光源上的不同点成像到聚光器孔径中。在正确配置的荧光显微镜中,结果是最佳的图像对比度和分辨率。在理想的情况下,用一组会聚的波前对样本进行浸泡,每个波前从光源上的不同点成像到聚光器孔径中。在正确配置的荧光显微镜中,结果是最佳的图像对比度和分辨率。在理想的情况下,用一组会聚的波前对样本进行浸泡,每个波前从光源上的不同点成像到聚光器孔径中。在正确配置的荧光显微镜中,结果是最佳的图像对比度和分辨率。

光源和灯柱

为了在荧光显微镜中进行严格的定量分析,试样照明必须在整个视场上在时间和空间上恒定。随时间的不稳定性通常反映由于电源输出变化而发生的灯辐射的波动。相反,在弧光灯中最经常出现的空间干扰来自被称为闪烁的现象因为等离子球在电极上来回移动。闪烁通常由电源波动,电极电阻的小变化或机械振动产生。在恒定直流电和稳压电源下工作时,基于灯丝的光源(如常用的卤化钨灯)非常稳定。一般来说,光源应选择其光谱含量,灯丝尺寸与客观后孔径面积,空间和时间稳定性以及场照明的均匀性相比较。还必须小心注意光源的强度,因为激发滤光片通过的窄波长带仅包括总照明装置输出的非常小的一部分。

选择用于荧光显微镜的光源的主要考虑因素是与所研究的荧光染料的量子产率和吸收相关的紫外和可见光光谱分布。此外,光源必须与捕获图像所使用的检测器的灵敏度兼容,无论是人眼,传统胶片,光电倍增器,强化视频管还是数码相机系统。选择还取决于照明模式。Widefield荧光显微镜的要求可以通过弧光放电或钨卤素光源实现,而共焦和多光子显微镜则需要适应各种激光系统。钨和钨 - 卤素白炽灯由于其大部分发射发生在光谱的红色和红外区域,而大多数荧光团被紫外,蓝色和绿色波长激发,因此使用钨和钨 - 卤素白炽灯的成功有限。另外,弧光放电灯的光输出比通常用于透射光照明的12伏石英卤素灯亮10至100倍。广角荧光显微镜最受欢迎的照明光源是汞弧灯,它通常通常包含在基础模型显微镜配置中。在某些情况下,采用氙灯和金属卤化物弧灯,但这些灯通常仅限于光谱和强度分布与特定荧光基团要求相匹配的特殊环境。

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汞和氙灯的设计类似,除了灯泡外壳中的物理尺寸和气体。汞灯包含两个高压密封在石英玻璃灯泡电极,也包含汽化元素汞。当电源通电时,一系列高电压脉冲被发送到电极,电离一小部分汞气,点燃灯。发射后,电压降低,电离的气体用于携带电流并产生在两个电极之间形成的等离子体球。在灯工作期间,汞的蒸发会在玻壳内部产生大量的热量和压力,最终产生高强度的光。汞弧灯产生的光即使在紫外和可见光谱范围内连续,集中在365,400,440,546和580纳米的离散波长。氙灯在整个光谱范围内具有更均匀的强度分布,从紫外到红外。荧光染料的选择对于确定荧光显微镜的适当光源至关重要。一些荧光探针具有与突出水银线一致的激发带,而其他荧光探针受益于氙灯的更均匀分布的照明。

为了实现科勒照明并避免荧光图像中明亮和黑暗的区域,在荧光显微镜中适当对准弧光灯是至关重要的。因此,通常可以通过正确的灯对准的稳定性以及用于保持对准的调节旋钮的效率来判断灯箱的质量。灯座应该配备灯中心螺丝,以便将弧形图像对准物镜后孔,并且灯箱应该包含一个红外滤光片以阻挡远红光和红外线中的长波长,从而产生大量的热量。几个灯箱设计有一个内置的红色抑制滤波器(例如,一个Schott BG38)或用于这种过滤器的槽,以消除在某些应用中通过视场看到的微红背景。此外,灯箱本身不应泄漏有害的紫外线波长,并且,如果在操作过程中无意中打开了外壳,则最好应装有一个开关,以自动关闭灯泡。最后,灯箱应足够坚固以在运行中承受可能的燃烧器爆炸。

荧光显微镜应用的广泛多样性经常需要一系列光源来满足特定荧光团和成像条件的要求。在某些情况下,与超灵敏相机系统结合可能需要非常低的辐射,而对于其他研究,为了杀死活细胞或选择性地漂白荧光团,可能需要强烈的激光激发。波长要求通常跨越光谱的整个可见光区域,以及部分紫外线和红外线。由于单一光源无法满足这些多种照明要求,因此制造商现在提供的适配器可将两个或更多个灯同时连接到单个显微镜。

荧光滤光片组合

如前所述,穿过垂直照明器的透镜和光阑的光最终遇到容纳在光学块中的激励滤波器,该光学块定位成与照明器光路和显微镜光学系统之间的轴向相交重合。激发滤光片从灯产生的宽光谱中选择一个窄波段,并将它们传递给二色镜,然后反射光线穿过物镜并照射到样品上。物镜聚集的荧光发射再次通过二色镜和发射或屏障滤光片,然后在固定目镜光阑中形成图像。用于在宽视场荧光显微镜中隔离波长带的通用滤光片包括有色玻璃滤光片和干涉薄膜滤光片(或两者的组合)。为荧光显微镜照明和成像方案中的每个步骤确定适当的过滤器可能会引起混淆,因为涉及大量的过滤器制造商,每个过滤器制造商都会为荧光文献提供专有的字母数字命名法。

典型的荧光滤光片块的解剖结构在图7中示意性地示出,以及二色镜,激发和屏障滤光片的相关光谱轮廓。过滤块通常与制造商提供的定制工具组装,以便操作员可以更换过滤器和双色镜。激发和屏障过滤器通过固定夹,光学胶或圆形螺纹固定件固定到位(见图7)。通常,这些滤光片可以在不打开光学模块的情况下被移除,因为它们位于平坦外表面上的凹陷孔上。更换双色镜更加困难,并且需要完全拆卸块来进入内部。大多数遮挡部分采用45度对角线连接,通过保护内部并以适当的角度支撑二色镜来提供双重任务。取下固定块部分的扣件(销钉或小螺钉)后,可通过松开或移动固定夹取下镜子,然后非常小心地将其从模块中取出。应该小心处理二色镜,因为干涉涂层通常不受保护并且易于刮伤。几家提供显微镜公司的过滤器制造商也为各种荧光应用提供多种售后过滤器和二色镜。取下固定块部分的扣件(销钉或小螺钉)后,可通过松开或移动固定夹取下镜子,然后非常小心地将其从模块中取出。应该小心处理二色镜,因为干涉涂层通常不受保护并且易于刮伤。几家提供显微镜公司的过滤器制造商也为各种荧光应用提供多种售后过滤器和二色镜。取下固定块部分的扣件(销钉或小螺钉)后,可通过松开或移动固定夹取下镜子,然后非常小心地将其从模块中取出。应该小心处理二色镜,因为干涉涂层通常不受保护并且易于刮伤。几家提供显微镜公司的过滤器制造商也为各种荧光应用提供多种售后过滤器和二色镜。

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荧光滤波器设计包括长通,短通(边缘滤波器)以及窄带,中等和宽带通滤波器系列。几个常见的滤光片轮廓的例子由图7中的光谱图示出。图7中的发射滤光片光谱(蓝色曲线)由具有约575纳米的截止波长的长通滤波器产生。更长的波长通过滤波器传输,而更短的波长被阻止。来自同一组的窄带通激发滤波器(红色曲线,图7)具有大约20纳米的带宽,而二色镜(绿色曲线)具有接近介质(455-490纳米)的透射区域和宽带通滤波器-775纳米)。由于二色镜有效地用作绿色的长通滤波器,黄色和红色区域的可见光谱(560至700纳米),它在滤光片组中被如此处理。关于如何使用荧光团吸收和发射光谱分布来选择用于荧光显微镜的适当滤光器组的工作知识对于成功实施该技术是必不可少的。

双色镜(或分束镜)是荧光显微镜滤光片组合中最关键的组成部分,它类似于通过多层介电材料制造的紧密公差的长通干涉型滤光片。二色反射镜与标准干涉滤光片的主要区别在于反射镜是专门设计用于在定义的边界波长进行反射和透射,并且必须相对于显微镜和照明器光轴以45度角进行操作。将二色镜设置为使干涉涂层面向激发光源,以便通过光学系统以90度角反射短激发波长至样本。相同的反射镜也必须充当透射滤光片,以将来自物镜的长波长荧光发射传递到像平面。由于几乎全反射和最大透射之间的波长过渡区域通常限于仅20或30纳米,所以二色镜能够精确地区分激发和发射波长。

荧光滤光片组被设计成使得特定的激发波长带与二色镜中的反射区域完全匹配。其结果是激发光通过显微镜和样品的有效反射。来自样品的荧光发射必须与二色镜中的高透射区域匹配,以使这些波长能够通过检测器。屏障滤波器在整个方案中不那么重要,但仍然在确保散射和反射的激发波长,来自除目标之外的探针的荧光以及由于自发荧光引起的一般背景强度被去除方面发挥重要作用。创建过滤器集最重要的因素是确保传输,反射,并且所涉及的过滤器的排放概况在适当的区域中匹配。否则,激发波长可能会穿过二色反射镜并使图像模糊,或者荧光发射会不经意地在反射镜处反射而损害图像亮度。

即使在表面上完美匹配的滤光片组合中,也可能出现各个滤光片的光谱轮廓之间的轻微重叠以降低性能。特别令人关注的是激发滤光片和二色反射镜之间的串扰,这使得一些激发光能够通过反射镜并从滤光片块的壁反射。如上所述,以高倾斜角度反射的光可以部分地透过屏障过滤器,以减少图像对比度。这种通过过滤器的泄漏称为渗透交叉,并且几乎所有的过滤器组合都会出现或多或少的情况。滤光片制造商和显微镜公司都关注的主要领域之一是改进荧光滤光片组合的设计,以降低交叉水平。

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荧光滤波器组的几种配置如图8所示。滤波器组转塔(图8(a))包含五个模块,可同时调查至少该数量的荧光团,并在滤波器组合之间进行快速切换。其中一个炮塔插槽通常填充有一个虚拟光学模块或者留空以用于透射光观测。激励平衡器(图8(b))对激励频谱进行微调以对双重或多重标记的样本进行成像,其中包含安装在旋转接头上的单个干涉滤波器。旋转激励平衡器的调整杆将滤波器的带通透射区域移动到更短的波长。从而,当平衡器滤波器从0度的入射角(垂直于垂直照射器轴)旋转到45度的最大旋转角时,滤波器的带通区域可以被移动范围在25和50纳米之间的值。激发平衡器可以单独或串联使用,以改变观察下的荧光染料的激发带宽,以均衡发射强度。此功能可以微调含有多个探针的样本中的荧光团强度,以便例如减少一个探针的荧光发射,同时增加另一个探针的强度。激发平衡器可以单独或串联使用,以改变观察下的荧光染料的激发带宽,以均衡发射强度。此功能可以微调含有多个探针的样本中的荧光团强度,以便例如减少一个探针的荧光发射,同时增加另一个探针的强度。激发平衡器可以单独或串联使用,以改变观察下的荧光染料的激发带宽,以均衡发射强度。此功能可以微调含有多个探针的样本中的荧光团强度,以便例如减少一个探针的荧光发射,同时增加另一个探针的强度。

薄膜镀膜技术的快速发展可以通过在单一干涉滤光片中产生多个透射峰值以及在二色镜中制造交叉反射和透射带的能力来证明。如果匹配得当,两个多波段滤光片和一个双色镜可以组合成一个多重荧光滤光片组,可同时激发并观察几个荧光团的发射。过滤器套件可从制造商处获得,适用于同一标本中的两个,三个,甚至四个荧光团。多个滤光片组的主要问题是它们的费用以及当从一个荧光探针发射通过用于另一个的带通区域时发生的交叉或渗透过量。在一些标本(和过滤器组)中,渗透对背景强度和图像对比度有显着影响。许多研究人员更喜欢用优化的滤光片组分别对每个荧光团进行成像,然后将这些图像组合成一个复合物。

先进的荧光技术通常需要使用具有单个双色镜的多个激发和发射滤光片。为了便于进行这些调查,许多荧光显微镜都配备了电动滤光轮或滑块,其中包含多达6个独立滤光片(见图8(c))。设计用于滑块的显微镜在垂直照明器中包含一个用于插入滑块的特殊插槽,或者可以使用滤光片滑块代替通常包含中性密度滤光片的显示器。在一些显微镜设计中,也可以通过垂直照明器来调节发射滑块,或者在照明器和观察管之间安装辅助中间管以容纳滑块。包含激发滤光片的机动化滤光轮单元通常夹在直立和倒置显微镜的中性密度滤光片和灯箱之间的垂直照明器光路中。同样,机动发射滤光轮单元以立式显微镜设计放置在垂直照明器和目镜观察管之间,但通常通过与用于倒置仪器的检测器相同的外部端口连接。激发和发射滑块和电动滤光轮对于具有单色双色镜的双激励和三激发应用非常有用。通过消除在观察单个样品时重新定位过滤块的需要,这些附件使研究人员能够获得图像之间的准确配准。

荧光显微镜的目标

在所有形式的反射光学显微镜(包括荧光)中,图像强度是客观数值孔径和放大倍数的函数。实际上,强度或亮度(定义为每单位面积和时间的光子通量)增加了数值孔径的四次幂,但仅与放大倍数的平方成反比:

强度α(NA obj4 / M 2

其中NA是客观数值孔径和M是放大倍数。从这种关系可以明显看出,最亮的荧光图像将通过高数值孔径和低放大倍数(例如0.75 / 20x)的物镜进行采集。例如,数值孔径为1.4的60x计划复消色差油浸物镜理论上会产生比相同数值孔径的100x物镜更亮的图像,但需要考虑权衡。增加内部透镜元件的数量(与最高数值孔径物镜一样)会使内部透镜表面的自发荧光和强度降低反射相应增加。通常,制造商在荧光显微镜的推荐目标中,最高校正因子与增加透光率之间的折中。

一般来说,高数值孔径石油(1.3至1.4)和水(1.2)浸没计划萤石和计划复消色差物镜产生最明亮的荧光图像,因为它们具有巨大的聚光能力。这些目标显示出色的色彩校正,因此能够将大范围的荧光发射波长聚焦在同一平面上。复消色差和萤石物镜的光透射特性优异,低至约350纳米,这是检测在紫外区激发的荧光染料(如DAPI,Hoechst,Alexa Fluor-350和AMC)的绝对要求。尽管拥有众多内部透镜,但这些物镜由低荧光玻璃和防反射涂层制成,以最大限度地减少背景荧光并获得非常高对比度的图像。

为专门应用设计的目标广泛用于荧光显微镜。该类别包括高数值孔径水浸式,多浸入式(油,水和甘油)以及具有石英镜片元件的紫外线物镜。对于活细胞成像应用来说,为了在厚的(0.5-2毫米)培养瓶壁上观察标本,需要带有修正环的长工作距离物镜。具有非常长的焦距(工作距离)的目标有利于厚标本深处的检查,这些目标可从几家制造商处获得,用于通过空气或水覆盖玻璃进行成像。长距离工作距离的水浸没物镜设计用于没有玻璃罩的情况下也使用特氟龙头锥,以便物镜可浸入水溶液中。在工作距离为20到30毫米(包括约5毫米水)的紫外线激发(340纳米)下产生类似的目标。对于相对较低的放大倍数调查,建议使用具有非常高数值孔径(0.75至0.95)的20倍水浸物镜。这些目标虽然相当昂贵,但在荧光团浓度和/或量子产率很低的情况下会产生非常明亮的图像。

荧光显微镜配件

制造商不断为他们的仪器生产有用的附加附件单元,以增加荧光显微镜中不断增加的成像应用的可用选项。例如,一些矩形视场光阑(见图9)可以作为一些显微镜的选项,可以限制被照亮的样本区域以提高对比度并减少光漂白。模块化视场光阑替代了垂直照明器中传统的虹膜视场光阑(也是一种可移动模块),其设计与数字成像传感器的纵横比相匹配。矩形场停止提高科勒照明的效率并降低电子传感器的信噪比。作为一个额外的好处,在解卷积研究中使用可编程扫描阶段时,可调整图像矩形大小以与阶段步长一致。与矩形视场光阑相似的模块中的针孔可用于需要高度限制照明领域的应用。

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其他配件包括双灯外壳适配器,可使两个光源(如汞灯和氙弧灯)同时连接到垂直照明器。专门用于激发激光的照明器也可用于全内反射荧光(TIRF),荧光寿命成像显微镜(FLIM),比例成像和光漂白恢复实验。此外,主要制造商提供的大多数研究级荧光显微镜都可以适应各自的激光扫描共聚焦附件。直立式显微镜通过三目观察管接受共焦扫描单元,而倒置仪器可将光束扫描仪附着到显微镜框架的侧面或后面端口。插入垂直照明器和观察管之间的双端口可用于引入附加光源或将荧光指向多个检测器。大多数这些单位都可选配C-mount适配器或标准显微镜端口配件。

设计用于电生理学研究的荧光显微镜已变得非常复杂。许多都配备了专门的减振阶段,可以接受各种各样的显微操作器附件,用于使用荧光,红外微分干涉对比(IR-DIC)和传统的明场对比度增强成像技术。摆动鼻托可以快速无振动地交换物体,以防止在对活细胞和组织进行成像时干扰标本或气泡的侵入。新的高数值孔径长工作距离2倍和4倍微距镜头(物镜),配备专门的滤波器组合模块,可以在生物体内进行荧光宏观观察。另外,几家制造商提供荧光垂直照明器和滤光片组作为立体显微镜的附件。

放大系数为1.25x至1.5x有时可作为垂直照明器的选件,但应尽可能避免使用辅助镜头,这是由于引入空放大引起的固有问题转换成荧光图像。几种模块化垂直照明器设计包括用于在照明器上方安装包含多个照相机端口的分束器模块的规定,以增加成像能力。考虑到现在可用于荧光显微镜(包括鼻托,冷凝器,滤光轮和平台)的各种电动附件,研究人员可以使用比以往更先进的成像技术。制造商在为许多复杂的荧光应用设计附件的过程中付出了大量的努力,这些应用一度只能通过使用来自各种来源的售后零件构建的显微镜来实现。随着荧光显微镜成为细胞生物学,神经生理学和临床领域越来越重要的工具,

倒置荧光显微镜设计

垂直荧光照明器的类似版本可用于倒置(组织培养)显微镜支架。倒置的架子还允许在反射光荧光和透射光显微镜的各种对比增强技术之间组合或交替。研究级倒置显微镜具有多个(多达六个)输入/输出端口,通常在框架的每一侧具有单个端口,以及在底部下方的一个或两个端口(上部和下部)和底部端口的显微镜。在某些型号中,可以从三个或更多端口同时获得原始图像,而无需使用中继镜。这种连接水平可以使用多种光源,滤光轮和相机系统进行复杂的荧光分析。用于倒置显微镜的水银和氙灯泡可配备标准多元素或非球面收集镜头,以提高性能并减少紫外和红外光谱区域的像差。此外,广泛的灯箱适配器可用于附加几个照明源,类似于可用于直立显微镜的附件。

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图10显示了现代倒置(组织培养)荧光显微镜的剖面示意图,该显微镜配备有珀尔帖冷却的CCD图像传感器和传统的35毫米胶片相机系统。尽管胶片相机的使用受到限制,但大多数倒置显微镜仍在前基座的下部包括用于这些附件的端口。图10所示的显微镜可以使用安装在支柱上的钨卤素灯箱执行传统的明场透射照明(带或不带对比度增强)。使用汞或氙弧放电灯用于荧光显微镜,使用连接到特别配置的后端口的反射光照明器。孔径光阑和现场光阑以及中性密度滤光片,靠近显微镜后部的端口进入。在一些倒置的显微镜模型(未示出)中,可以使用包含可分离膜片的L形反射光照明装置来改善对附加附件的后部辅助端口的访问。通过图10中的显微镜的光路用黄色表示透射光,用紫色表示未滤光的弧光照明,用绿色表示滤光荧光激励,用红色表示荧光发射。

现代倒置显微镜框架,像它们的直立对应物一样,是计算机设计和制造的复合材料,用于结构和热稳定性。此外,机械舞台部件和电路结构设计的行程较短且刚性较高,以避免在常规操作(如DIC棱镜插入或调整客观矫正环)期间操纵鼻镜时发生俯仰和偏航。高级物镜转换器能够实际消除时间推移过程中的焦点漂移和延长的荧光观察。标准直立显微镜不可用的其他舞台选择包括滑动和360度旋转舞台,玻璃舞台插入板,加热板,培养皿和板支架,以及二氧化碳培养箱。

具有模块化设计的倒置显微镜可以轻松配置用于电生理学,体外受精,显微操作,高分辨率DIC,视频增强观察以及各种先进荧光技术的研究。该仪器也很容易适应共焦和多光子显微镜。电动配件包括百叶窗,滤光轮,旋转鼻架,荧光块转台,聚焦驱动器和电容器。当与长工作距离,水浸,紫外激发和相位对比等先进物镜配合使用时,所有这些物镜均具有高度的光学校正,倒置显微镜是对活细胞和组织进行荧光检查的理想工具。

结论

在荧光显微镜中,样品内局部荧光团浓度之间的广泛变化,加上消光系数和从一种荧光物质到另一种荧光物质的量子产率的差异,显着影响了对于给定量的激发强度产生的发射信号。考虑到许多样品在任何特定的视场中仅含有微量的荧光物质,这些组合因子产生的平均荧光发射水平比激发强度低4-6个数量级。此外,还有一些更复杂的荧光技术,如原位杂交和共振能量转移(FRET)的发射信号强度可以比激发的发射信号强度小9至10个数量级。为了补偿激发和发射强度之间的这些大的差异,现代荧光显微镜必须能够以超过十亿倍的水平衰减激发照射而不干扰荧光信号。

荧光显微镜的主要特征是对特征波长吸收和发射光的荧光探针的高度特异性,导致该技术在复杂混合物中以非常低的浓度选择性检测目标物种的能力。此外,荧光的高灵敏度和空间分辨率使单个分子能够在显微镜的光学分辨率下被精确定位和研究。局部环境因素也对荧光发射影响很大,因此该方法是pH,粘度,离子浓度,分子距离和方向,膜电位,疏水性,电荷分布和扩散系数波动的理想探针。荧光的时间分辨率限于激发荧光探针的寿命,其可以在纳秒量级。由于许多生物过程发生在这个时域,衰变动力学可以揭示关于细胞过程的动态信息。总之,这些因素在荧光显微镜应用于细胞生物学中至关重要。

荧光显微镜在过去的十年中以惊人的速度发展,加上激光技术,固态探测器,干涉薄膜制造和基于计算机的图像分析等方面的快速发展。高数值孔径水浸目标的发展进一步协助了对生物现象的研究,使研究人员能够在自然环境中深入探测活细胞。随着显微镜制造商响应研究界不断变化的需求,高级荧光仪器和配件的开发无疑将继续下去,他们对探索大自然神秘的最终贡献可能最终具有深远的意义。


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