线虫显微成像--从宏观到微观

2019-02-22 10:24:54 普赫 431

线虫是神经发育、细胞分化、细胞凋亡和衰老研究常用的模式动物。线虫结构简单,培养方便,繁殖迅速,对实验条件的要求也低于哺乳动物组织和细胞。线虫研究中,最重要的工具就是显微镜。从幼虫的挑选、基因注射到功能成像,都会用到显微镜系统。

线虫挑选:

因为线虫成虫长度大约1mm,直径小于100um,放大到10-40倍范围后,肉眼即可清晰分辨。这个放大范围既可以用显微镜,也可以用体视镜实现。通常研究人员对选择使用体视镜挑选线虫成虫,一方面放大倍数足够,另一方面原因是体视镜镜体与基座距离较远,操作的空间比较大,容易操作。

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线虫挑选:显微镜型号OLYMPUS SZ61

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线虫荧光筛选:显微镜型号OLYMPUS SZX16

显微注射:

修改线虫的基因非常容易,不管是稳转或者瞬转,都可以通过将基因组注射至虫体末端生殖腺内即可。这个操作通常是在特殊的倒置显微镜上进行的,放大倍数通常在200-400倍。

这里的倒置显微镜与通常观察哺乳动物细胞的显微镜不同,观察细胞的显微镜只需要看到平面信息即可,但是线虫显微注射时,不仅需要看到平面信息,还需要看到立体信息,以方便定位注射点。这就需要显微镜配备霍夫曼成像或者DIC成像模式,最好是高分辨率DIC成像模式。高分辨率DIC成像模式,可以对厚组织的线虫虫体清晰成像,同时提供了三维立体的效果,方便注射操作。

另外还需要配套的显微注射系统。不同于IVF等哺乳动物胚胎细胞的操作需要吸附和注射两部分系统,因为线虫虫体经过固定,只需要一侧的注射针即可。当注射操作量较大时,人们往往喜欢气动甚至电动的注射系统,减少操作的工作量。

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线虫显微注射:显微镜型号OLYMPUS IX73

功能成像:

在进行线虫的功能成像时,因为线虫通常位于琼脂载玻片上,盖上盖玻片后使用正置油浸物镜可以使镜头更贴近虫体,成像更加清晰。对于固定或者左旋咪唑麻醉的线虫,可以使用普通正置显微镜或者正置共聚焦,实现高分辨率荧光成像,但是同样由于线虫虫体厚度原因,需要搭配高分辨率DIC成像模式,以获取明场图片。

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线虫功能成像:显微镜型号OLYMPUS BX53

但是对于活的甚至是运动的线虫,尤其是运动神经研究等,不仅需要上述正置显微镜和高分辨率DIC模块,更重要的是能否使视野随着线虫移动。这就需要电动载物台和特殊的软件相配合,根据线虫荧光蛋白的位置变化,控制电动载物台进行实时的追踪。

总结各类解决方案:

虫体挑选所用的体视镜,可以选择SZ61/51,配合10倍目镜时,放大倍数在10-40倍。操作简单,节省占地。

显微注射所用的显微镜,可以选择IX73,配合旋转载物台IX2-GS,方便定位虫体生殖腺位置。需要配合RC模块或者HR-DIC高分辨DIC成像模块,可以实现高分辨率的线虫立体成像。

功能成像时,如果是固定的线虫,可以选择BX53/63、IX73/83配合LED荧光光源和高灵敏黑白sCMOS相机,可以轻松实现线虫的高分辨率荧光成像。如果需要明场成像时,也需要配合HR-DIC高分辨DIC成像模块,对于线虫这种厚组织样本,成像效果最好。


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