激光共聚焦显微镜像差

2018-08-17 16:53:35 admin 747

设计改进简化了共焦显微镜在某种程度上,它已经成为一个标准的细胞生物学研究工具。然而,在激光共聚焦显微镜变得越来越强大,也越来越要求其光学元件。事实上,光学畸变导致在宽视场显微镜图像质量的细微的缺陷可以在共聚焦显微镜的毁灭性影响。不幸的是,共焦显微术的严格的光学要求往往是隐藏的,保证了清晰的图像的光学系统,即使在显微镜下表现不佳。光学制造业提供广泛的显微镜物镜,每个设计的具体应用。这份报告显示,参与目的设计的取舍会影响激光共聚焦显微镜。

1 Chromatic Aberrations的两物镜

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在过去的十年中,共聚焦显微镜已从一个技术有限公司专家在显微镜为标准的研究工具。其应用结果一样,在激光共聚焦显微镜技术的快速发展为成熟的用户界面的商业共聚焦显微镜系统增殖。最新的系统是近交钥匙系统,即使是新手显微镜可以快速收集高质量的图像。具有讽刺意味的是,同样的技术发展,已经在实验生物学刺激共焦显微术的传播也推动了共焦显微镜光学极限的一种方式,使得理解激光共聚焦显微镜的光学性能比以往更重要。

共聚焦显微镜最常见的应用是比较分布在同一个细胞或多个探针的行为。这样的研究已经由共聚焦显微镜,能够有效地收集荧光多重色彩和发展新的染料,荧光显微镜的有用扩展频谱的发展成为可能。根据显微镜的配置,这样的研究可能需要使用光学,光从紫外线到红外线的波长。准确的彩色成像的要求已经通过定量显微镜比色方法的发展进一步增加,如离子浓度的荧光比率测量。

色差的光学设计自由只是方程式的一部分,同时考虑单色像差和高光效率,这样的参数字段的大小、平坦度、工作距离、形象和能力深入到水生物组织。由于光学显微镜的设计反映了一个妥协的各种参数,制造商通常设计多种不同的显微镜物镜,每个代表一个特定的设计权衡每个适合于特定的应用程序。在这里讨论的研究表明,显微镜物镜的选择会对实验结果产生深远影响的激光共聚焦显微镜。他们强调仔细选择显微镜的物镜,用于实验的应用是合适的重要性。

一个理想的透镜将光线中的所有色彩的相同点。在现实中,所有的镜头都有色差,属性,不同颜色的光被聚焦到不同的点。当观察一个样品通过显微镜目镜,这种缺陷使物体出现彩色边缘。当样本成像的彩色共焦显微镜,这种缺陷导致不同颜色的光被聚焦到不同激发点在排放在样品从不同的点收集的样品和不同的颜色。在图像平面上的水平位移,称为横向色差,在不同放大倍数的不同颜色的结果。这个问题可以通过限制分析的显微镜的视场中心最小化。然而,垂直位移沿轴线的颜色,称为轴向色差,目前整个显微镜的视场。这显然是对任何研究者试图用彩色共焦显微镜确定多个探针的相对分布问题。提出的图像图1到3显示彩色共焦成像结果关键取决于显微镜的物镜的性质。

数据提供一个平场氟40倍的物镜性能的比较,这是专为最大的光传输,与一个平场复消色差透镜100x目的,设计最小色差。用于比较的一个方面,收集是一个垂直系列的反射图像从盖玻片上,使用488或647纳米的光。作为光的不同颜色是由一个单一的表面反射,无色差透镜聚焦的不同颜色的同一焦平面。当作为一个垂直的横截面,图像采集与理想的镜头会显示一个水平线,两种颜色完全重叠。在图像的顶部,如图1(a)说明XZ截面的玻璃反射,与焦(Z)轴垂直,并表明平场复消色差透镜100x目的不可信的工作接近这个理想,解决两种颜色的光的深度在0.1微米的一个。相比之下,微创矫正40x平场氟目的检测反射647纳米的光约1.2微米以上的488纳米的光。在玻璃反射的影像,647纳米的光是红色显示,488纳米光显示为蓝色。比例尺表示距离1微米。

2校正轴向色差

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在荧光这种垂直差异的影响是明显的。这个面板的底部的一半(图1(a))显示,珠三荧光标记图像卷垂直截面。当成像色差100X的平场物镜,三种颜色是一致的,导致在一个白色的圆形图像,合理。相比之下,40倍的物镜产生影像的远红荧光(680纳米的排放,蓝色)是明显的垂直位移,或红色(600纳米)或绿色(520纳米)的荧光。此外,一个轻微的横向位移的远红荧光反映横向色差。

提供一个生物试样,利用的事实,最终可以标记的培养细胞用荧光标记的内吞体。大量的分子,包括在每个体确保每个将包含相同的比率荧光探针。因此,内涵体提供彩色共焦成像优异的测试他们目前的次解析度对象颜色会反映在每个荧光团的荧光生物样品的相对贡献。图1(b)显示彩色图像的细胞内涵体已标记为fluoresceintransferrin(f-tf,荧光绿色)和转铁蛋白(TF Cy5荧光标记,远红光),收集使用色差100X平场物镜。共定位两探针是明显的在不断的橘黄颜色的个体内比较明显比较高倍率图像f-tf(图1(c))和Cy5 TF(图1(d))。在这些图像(图1( b)通过 1(d )),比例尺是一个长度为10微米。

当切换到40倍平场氟目的,然而,细微的差别在焦平面明显甚至之间的红色和绿色荧光,如细胞标记与TF结合荧光素和罗丹明( 2(a ))。在焦平面之间的差异远红色和绿色荧光结果惊人的差异,表观分布f-tf和Cy5 TF,现在似乎是完全不同的( 2(b ))。

一个细胞生物学家评估各种探针的相对分布,这些位移会产生灾难性的后果。差异在焦平面可以规避总结整个垂直系列的图像到一个单一的投影,从而消除效果的差异在焦平面上的两种颜色( 2(c ))。在投影每吞一致的黄色显示每吞两探针的常数比。然而,当这个程序丢弃所有的垂直信息,这不是一个适当的方式呈现的共聚焦图像。轴向色差的影响也可以通过测量不同颜色的轴向偏移,并从焦平面适合每个颜色采集图像最小化。此过程的一个例子是显示在 2(d ),这表明联合绿和远红外图像采集1.2微米除了与40倍氟物镜平场。比例尺的图像 2代表一个 10微米的长度。修正了将图像从不同的焦面是明显的对比图像的单个探针,如 3 。而 3(a )和 3(b )显示可怜的协议之间分配f-tf和Cy5 TF在采集的图像在同一焦平面,比较 3(b )和 3(c )表明,远红外图像可以叠加的绿色荧光图像采集的1.2微米深。在这些图像( 3(a )在 3(c )),比例尺对应一个长度为5微米。

而色差产生不同颜色的光被聚焦到不同的点在图像体积,球差可以深刻地减少激光共聚焦显微镜信号。球差透镜聚焦的轴向和周围光线的不同点,从而模糊一点光源的图像。在共焦针孔,有效地增强了图像的对比度通过拒绝了聚焦光相同的方式,有效地消除了大部分物体成像的球差的荧光。

 3 双色焦平面校正

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许多样品,球面像差的主要来源来自于浸泡介质和安装介质折射率之间的差异。直到最近,最高分辨率、最佳矫正显微镜物镜被设计为使用石油作为浸泡液。为实现这些物镜,球差最小化,只有当整个光路具有浸油的折射率(这是与玻璃相同)和增加的距离为具有不同折射率的介质。由于大多数样品特别是活体样品-安装在介质的折射率,明显低于浸油,球差也因此限制使用油浸物镜体积图像的深度。

4显示了影响球面像差在激光共聚焦显微镜,在油浸100x平场复消色差的目的是用来收集图像标记的细胞f-tf安装深度在0微米(表面的盖玻片)( 4(a ))或35微米到水介质 (图4(b ))。在这两种情况下,核内体出现清晰的,但累积的球面像差中光路的35微米到水介质中具有深刻地影响,荧光信号在 4(b )。规模代表长度为10微米,每个图像呈现在 4 

近年来,光学厂商的物镜,使用水作为目的浸没介质的设计解决了这个问题。用于液体样品的折射率,配合浸泡和采样介质使球差独立成像深度。这使得这些物镜图像采集的工作距离允许深入,经常几百微米为样本。成功的设计是显示在 4((c)和(d) ),这表明细胞图像标记f-tf,收集零( 4(c ))或66微米到水介质( 4(d ))使用水浸泡60x平场复消色差物镜。在这里,荧光信号不受光路通过样品溶液中。这是新一代的高数值孔径,平场复消色差透镜浸水物镜有明显帮助共聚焦显微镜实现其潜在的三维生物成像。

这水浸物镜的色彩表现下降,油浸平场氟和平场物镜之前讨论之间的色差。横断面图像的反射玻璃表面的顶部, 如图5(a )表明,647纳米的光聚焦大约0.6微米以上的488纳米的光。类似的方式收集卷0或63微米到水介质中表明,这种差异是独立的成像深度。

左下方的图片的人在 5(a )表明,这种颜色差异结果在远红外图像的三标记珠被取代,无论是红色或绿色荧光图像。在荧光珠图像,520纳米的排放是显示绿色,红色的600纳米和680纳米的排放(远红外)排放在蓝。这个面板的右下部分显示在减少这种客观的球差校正盖玻片厚度的重要性。由于球面像差的校正取决于光学路径长度通过盖玻片,用项圈,是根据设定的盖玻片的厚度是可调的。而在离开珠截面设置测量的盖玻片厚度衣领收集(174微米),右边的图像以领失调的150微米的收集。球面像差从不当领的设置,结果严重衰减的荧光信号和妥协的垂直分辨率。虽然这种失调被选为戏剧的角度,我们强调的是,这样的错误是很容易在实践中遇到的由于盖玻片的实际厚度可以超过40微米左右的标称值变化。适当的衣领设置只能通过个体盖玻片测量保证。在所有的图像, 5(a )、焦轴是垂直的,和比例尺表示距离1微米。

 4 球面像差

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图像显示在 5( b)和 5(c )是一场两f-tf和Cy5标记的细胞TF,并被收集在一个深度为63微米到缓冲溶液。比例尺表示这两种图像10微米。虽然图像出现尖锐的轴向色差这个目的的影响,使分布f-tf和Cy5 TF出现离散( 5(b ))。尽管如此,投影的垂直系列图像这些细胞( 5(c ))表明两探针同样标签的所有内。在协议与反射图像显示在 5(a ),轴向色差同样明显的图像上收集在一个深度零微米(在盖玻片表面)。小的差异在焦平面上的红色和绿色荧光图像中的内涵体标记TF共轭荧光素和罗丹明( 6(a )),但f-tf和Cy5标记的TF再次出现离散种群内( 6(b ))。

两个探头的分布可以更好的比较时,允许在焦平面的差异和Cy5荧光图像相结合的TF图像采集0.6微米深。共定位两探头现在很明显在不断的黄颜色的内涵体显示在 6(c )。明显的差异分布在两个探头显示在图像收集在一个单一的焦平面( 6(d )和 6(e ))消失当Cy5 TF图像相比,图像采集f-tf 0.6微米深( 6(f ))。规模代表10微米,长度在 6(a )在   6(c ),对应于5微米, 6(d )通过 6(F )。

色差的影响也可以通过测量在内涵体标记多个探针荧光比值图像量化。半对数图的比例直方图给出 7(a )为标记的细胞f-r-tf,图像采集使用100X平场复消色差(红色曲线),40倍平场氟(蓝色曲线),和60倍平场复消色差透镜水浸物镜(绿色曲线)。 7(b )显示比直方图和Cy5标记的细胞f-tf TF使用相同的三个物镜。 7(a )显示比罗丹明荧光(红绿色)的排放量是相当稳定的所有三个物镜。相比之下, 7(b )显示,100X平场复消色差透镜仍显示最小变化的Cy5荧光素(远比红绿色),水浸60x平场复消色差透镜显示了更多的变化,和40倍平场氟更显。影响色差在60倍平场复消色差和40倍平场氟更明显时,分布的单个焦平面较用投影的图像垂直系列为每个物镜( 7(c )和 7(d ),分别)。在每一种情况下,在投影图像的荧光比分布窄的报道在内涵体两探针几乎恒定的比率,这是在任何一个焦平面图像歪曲。

 5 色差和球面像差在水中浸泡

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这里提出的研究表明如何生动的色差和球面像差妥协的共焦成像性能。同时,他们强调客观的选择的重要性,在激光共聚焦显微镜。可怜的色彩校正会导致多个探针的相对分布的错误解释,一个共焦显微镜的主要应用。比的量化,还演示了如何色差显微镜定量妥协。球面像差不匹配的浸泡和采样介质的垂直分辨率,可以导致恶化完全抹杀荧光检测。虽然在激光共聚焦显微镜提供高对比度的图像尤为明显,这些错误也妥协,通过对采集的图像进行传统的荧光显微镜和透射技术。

色差的特点一直主要涉及紫外荧光。其他的研究结果表明显著的轴向色差的远红一样,越来越有新的远红荧光探针,能够激励他们激光发展显微镜的使用范围。虽然这里的研究涉及点源的特性,这些样品容易显示问题,将是明显的(但不一定是明显的)更广泛的探讨。这种探针包括常用的离子浓度的荧光比率测量胞浆染料。

例如,在胞内pH指示剂SNARF-1荧光是由488纳米的光激发,和pH值的测量是从荧光的比率在580纳米到640纳米。对于薄壁细胞的胞质pH值的测量,这是很容易想象的荧光比率可以影响位置的细胞相对于绿色激发光分离的焦面,红光和远红光。虽然这些错误常常会简单地添加变化来测量(增加一倍或两倍的标准偏差在所提出的量化),他们也可以系统地影响比的测量,例如,当比较不同部位细胞的比值在不同厚度的。

 6 轴向色差在水中浸泡的物镜

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色差的最终结果,虽然没有在这里讨论的,是如何影响荧光检测。在共聚焦系统的色差,在体积和成像的不同体积的激发的激发波长和发射波长的结果之间的差异,其荧光信号。电子束扫描系统(大多数的共聚焦显微镜),这个信号损失加重的距离轴成像光斑聚焦远从共焦针孔。

必须强调的是,这些意见是不使用的数据给出的特定物镜独特的或特定的制造商。的颜色校正的特性同转载的60倍水浸液物镜三例和100X油浸物镜实例对量子和血滴镜站。显著的轴向色差已确定的物镜从所有的主要制造商。的确,色差的普及导致了替代显微镜设计,解决色差或施加特殊辅助校正透镜折射或避免完全转向反映物镜的发展。尽管如此,光学显微镜可能会继续发展,并与cfi60光学从尼康新一代的初步经验,公司表明,轴向色差修正有很大的提高。

从表面上看,它可能会出现一些物镜只是比其他人更好。然而,正如前面所讨论的,客观的设计代表了一种妥协的设计参数。这样,每个物镜反映了根据其预期应用不同的设计妥协。然而,它是可能的,研究人员将需要更多的比什么是目前在光学设计,迫使他们设计实验,不要伸展的目的设计的限制。

如果一个油浸物镜必须用于图像样本在水性介质中,例如,在活细胞-球面像差可以通过水介质或通过使用油,适合应用水光路引起的球面像差的光学折射率最小路径最小化研究。

 7 量化和色差

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色差问题有几种方法可以最小化。如果一个特定的实验需要一个客观的使用具有明显的色差,最明显的解决方案是简单地避免远红色荧光染料如Cy5一起使用。讨论的结果显示所有的测试物镜,绿色和红色荧光之间的令人满意的协议。一般来说,最好是使用染料的最大激发和发射波长附近的特定的一个特定的物镜已得到纠正。以上讨论的第二溶液,是收集各荧光图像在焦平面的垂直系列,根据焦平面两者之间的差异将不同颜色的图像。这是一个简单的解决方案,但不会在快速图像采集必须是适当的,与活细胞。分析不显示也表明,该解决方案不具有足够的精度,正确的图像用于比量化。一个更昂贵的(或不被广泛使用)的解决方案是使用双光子显微镜,它本质上是不受色差只要没有探测器针孔是用。然而,它仅仅是目前正在探讨的多色性。

 

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