显微镜照明

2018-10-12 10:52:53 Pooher Inc. 170

由于不正确地使用光源,所有频繁,精密且装备精良的显微镜不能产生出色的图像,这通常导致样品照明不足。 经过优化后,样品的照明应该明亮,无眩光,并均匀分散在视野内。

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有许多光源可用于照明显微镜,无论是常规观察还是关键显微摄影。由于其低成本和长寿命,最常见的光源是50或100瓦卤钨灯,如图1显微镜图的底部所示,其还详述了典型的现代透射光显微镜中的光学路径。在该图中,卤钨灯发出以3200K为中心的连续光谱(当设置在+9伏的灯电压下),然后在反射到分屏电容器之前通过集电极和场镜,并且到样品上。成像光线被显微镜物镜捕获,并通过目镜或通过分光镜指向几个相机端口之一。在整个显微镜的光学路径中,照明通过一系列光阑和透镜进行定向和聚焦,因为它从光源传播以照亮样本,然后进入目镜或相机附件。遵循科勒照明规则,实现显微镜光学元件的对准以优化现代显微镜的照明。有关透射光和反射光显微镜如何针对柯勒照明进行对准的更多细节将在我们为透射光和反射光设置显微镜的章节中讨论。上面图1所示的光学路径对于透射光显微镜是典型的,并且涉及许多透镜,光阑,反射镜和分束器,以通过显微镜引导光。

钨卤灯相对较亮,色谱中心为3200 K(设置在约+9伏时),但需要使用颜色转换滤光片将其色温升至日光等值。另一种流行的光源是75到150瓦的氙气灯,因为它具有非常高的亮度和长寿命,整个可见光谱的输出相对均匀,并且色温接近日光膜乳剂所要求的。在需要非常高的光强度的情况下,经常使用卤化锡灯。在荧光显微镜中,特别是用于关键显微摄影的目的,通常使用100瓦或200瓦的汞燃烧器。在过去的几年中,碳弧灯或锆球可能已被使用,但这些来源在今天很少见到。欲了解更多信息和可用于显微镜照明的广泛灯具的详细讨论,请访问我们的显微镜和显微摄影光源部分。


在反射光学显微镜中通过光学路径对源照射进行对准也是主要关注的问题,特别是在金相学,半导体晶片检测以及荧光显微镜中取得的显着新进展方面。反射光显微镜也用各种光源照射(如上所述),并可使用科勒照明进行调节以获得最佳性能。这在我们关于克勒反射光显微镜照明配置的章节中有更详细的讨论。反射光显微镜的照明路径也是几个交互式Java教程的主题,包括直接在下面链接的教程。

John Delly在其杰出书籍“通过显微镜摄影”中指出,80%到90%的提交给比赛,展览和科学出版物的显微照片是不正确对准的光学元件的受害者,导致样品照射不良。这是一般显微镜和显微摄影术中最常见的问题之一,许多大学实验室对学生显微镜的突然检查将揭示大量调整不佳的聚光镜和照明光源。我们怀疑在给定显微镜的整个物镜范围内,底座聚光镜和视场光阑的不正确对准和调整是显微摄影术中最大的误差来源。


适当照明的必要性怎么强调也不为过。通常情况下,25,000美元的显微镜通过不正确的照明和对准降低到手放大镜的水平,从而导致在科勒照明的最佳条件下用超过2000美元的显微镜拍摄的显微照片。本白皮书的配套部分涉及科勒照明理论及其实现(透射光和反射光),我们讨论了显微镜配置的关键方面,并且包含了各种交互式Java教程,以帮助学生掌握这些重要概念。


无焦点或非焦点照明 - 在光路中的某一点不形成光源图像的照明系统称为无焦点或非焦点照明。在电灯泡发明之前,显微镜专家在选择合适的显微镜照明光源方面受到限制。在白天,他们可以将自己的显微镜(或反射镜反射镜)指向天空,并使用云层作为原始扩散屏幕,将照明均匀地散布在整个视野内。仪器制造商还研磨镜面以产生凹面反射表面,以努力增加物体面内的光强度。云层和蓝天不是光源,它们可以很容易地在显微镜的光学路径内成像,因此是无焦照明的来源。室内和夜间工作迫使早期的显微镜专家依靠人工照明源,由于这些源产生的固有较低的色温,使得样品颜色以不同于在自然日光下观察到的不同强度,色调和色调。为了弥补这一点,显微镜专家们已经使用各种类型的蓝色滤光片来改变人造光的表观色温以紧密匹配自然日光的色温。但是,如果不在光路内某处形成光源图像,这些各种早期照明方法仍然属于无焦点或非焦点照明的范畴。


早期的调查显示,当在日光和人造光源之间旋转时,如果物镜的后透镜完全充满光线,则(实际上)在图像的光学特性或分辨能力方面没有明显变化。后来,科学家发现最重要的要求是照明的数值孔径至少要等于物镜的数值孔径。在19世纪,开发了新的照明源,并开发了一种新的“源聚焦”(后来称为临界或尼尔森照明)方法来改善显微照明条件。

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临界(或纳尔逊)照明 - 这种显微镜照明方法首先由英国显微专家Edward Nelson根据Ernst Abbe先进光学原理开发而成。纳尔逊光照被十九世纪后半期的显微镜专家非常成功地运用到二十世纪。今天,仍然有一些关键照明的倡导者继续使用需要外部光源的显微镜,或者在显微摄影不是问题的便宜的学生显微镜中使用它。


尼尔森照明依赖于使用亚平台聚光镜在样品平面上从燃烧的油灯(或其他均匀光源)产生火焰的聚焦图像,以在整个视场中实现均匀的照明条件。考虑这种照明方法时,光源的均匀性是重要的方面。由燃烧灯产生的火焰相当均匀一致,但其他来源如磨砂放大器灯泡,蛋白石灯泡或带状灯丝也可用于临界照明。图2说明了使用提供均匀照明源的假想油灯的临界照明的光学路径。


油灯火焰发出的光线必须通过底座聚光器聚焦(见图2),以便在微型滑板的样品平面产生火焰图像。实际上,在火焰的中心部分找到焦点通常是困难的(或不可能的),所以火焰的“边缘”通常聚焦在后续镜子的重新调整之后,使得图像的中央部分火焰填满了视野。进入显微镜的光量可以通过视场光阑来控制,视场光阑通常附着在外部(如果有的话)。必须有足够的光线进入显微镜才能完全填满物镜的背面,并且可以通过适当调整聚光器孔径光阑来控制这一点。将光源聚焦在样品平面上是不稳定的,并且通常会产生粒状,不均匀或有斑点的背景。这可以通过稍微散焦下聚光镜来产生更均匀的背景来克服。纳尔逊照明在很大程度上被更高效的克勒照明显微镜方法所取代。


柯勒照明 - 本主题的另一部分将对此主题进行更详细的讨论,但我们将简要介绍这里的主要方面。在科勒照明中,光源的图像聚焦在聚光器孔径光阑处,从而通过样本或物体的平面产生平行(并且未聚焦)的光。聚光器下方(孔径光阑处)的光源放大图像会产生一个宽光锥,这对于样品的最佳分辨率是必需的。聚光器孔径光阑的尺寸可以用来控制照亮样品的光锥的数值孔径,并减少不必要的杂散光和眩光。另外,聚光镜的玻璃表面上的灰尘和其他缺陷的成像被最小化。


高效的样品照明非常依赖显微镜中所有光学元件(包括照明光源)的正确对准。严肃的显微镜专家应该熟悉每个部件的调整范围,并且应该将这些与不同的样品和物镜对齐。不均匀的照明会严重影响显微照片的质量,导致“热点”,渐晕,色边,对比度差以及各种其他不良影响。一些最新的显微镜配备了不允许调节的“预先居中”灯,有些甚至供应没有横向调节机构的聚光镜。在进行显微摄影之前,确保这些显微镜在工厂进行适当的科勒照明是很重要的。仔细阅读显微镜说明手册和/或询问您的工厂技术代表,了解关于这些显微镜如何针对照明进行优化的重要细节。

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