激光共聚焦显微镜样品制备方法：细胞培养样品

随着生物学研究的不断深入，越来越多的研究要求在细胞体内(in vivo)，甚至是动物体水平上研究蛋白质功能或动态变化。而随着检测设备的提升、各种显微技术的发展和标记手段的提高，如激光共聚焦显微镜在生物学研究中的广泛应用，使得研究者能够迅速、准确地观察到蛋白质在细胞内的表达情况和定位。通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记细胞内的蛋白质和分子，为生物学的研究提供了更直观的观测手段。因此免疫荧光样品的制备也成为生物学研究中的基本技术方法。鉴于生物体内的复杂多样性，制备免疫荧光样品的方法也存在一些差异。本文主要介绍构建绿色荧光融合蛋白表达载体，并在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。 

1 绿色荧光融合蛋白表达载体的构建

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP) 及其突变体能在各种不同的生物系统中表达，这对细胞生物学的研究具有重要意义。而荧光蛋白的折叠能力及其同细胞内蛋白的融合能力，使研究 者能直接在细胞体内观察到蛋白质的特性。研究者不需要把蛋白质经过纯化、标记并再转移到细胞体 内的过程，可直接在细胞水平，甚至是整个动物体水平上观察。当研究者没有合适识别目的蛋白的抗体 时，在细胞内表达绿色荧光融合蛋白不失为一种快捷和合适的研究手段。

荧光蛋白的构建使用标准的分子生物学技术。通过 PCR 扩增目的蛋白的 cDNA，接入到荧光蛋白表达载体的多克隆位点。载体的构建方法和过程参考《分子克隆实验指南(第三版)》。在设计荧光融合蛋白前，研究者应考虑荧光融合蛋白的用途，使用何种荧光蛋白，及荧光蛋白插入的位置(N 端、C端或定位信号序列之后)。

2 荧光表达载体的导入

将构建好的荧光表达载体进行大量扩增，并通过质粒抽提试剂盒大量纯化，得到不含有内毒素的纯化质粒。将表达载体导入到培养细胞中后，经过培养即可进行荧光蛋白的检测。而将基因导入哺乳动物培养细胞的方法有很多种，生化转染法是很常用的导入培养细胞方法。常用的转染方法有:磷酸钙转染法和脂质体介导的转染法。这些方法都是通过 DNA 与化学试剂(磷酸钙或脂质体)形成复合物，促进 DNA 进入细胞。依据不同的细胞类型，采用不同的转染策略。磷酸钙转染法参考《分子克隆实验指南(第三版)》，而脂质体介导的转染法参考所使用脂质体的使用手册。

2. 1 玻璃片的处理

为了方便在激光共聚焦显微镜上观察，免疫荧光样品通常需要制备在载玻片上。培养的细胞需要在盖玻片上贴壁生长。盖玻片的厚度应小于 0. 17 mm。购买到的盖玻片需要用玻璃洗液浸泡处理一天以上，再用去离子水冲洗掉残存的洗液。盖玻片经过高温灭菌处理后，放置在细胞培养皿中，用于培养细胞。对于贴壁不牢的细胞(如 293T)，或者与细胞外基质相关的研究，玻璃片需预先包被细胞外基质，如poly-L-Lysine，Fibronectin，Laminin等。

2. 2 细胞培养和转染

哺乳动物细胞按照标准的培养方法进行培养。在进行转染细胞前一天，按1∶ 4的比例，将培养的细胞铺在含有玻璃片的细胞培养皿中。第二天细胞将生长达 50% 的密度。在转染细胞后，继续培养 1 ~ 2d，使得 GFP标记的蛋白的表达水平达到能被荧光显微镜检测的水平或实验所需要的时刻。

3 免疫荧光染色

使用预冷的 PBS 缓冲溶液洗涤细胞，去除残留的培养液。立即加入 4% 多聚甲醛(PFA)固定液。在室温固定15 min。用 PBS 洗涤残留的固定液后，用 0. 5% Triton X-100 处理细胞 5 min，这样可以通透细胞膜，使抗体等大分子能通过细胞膜，进到固定细胞的内部。但这样处理会破坏细胞膜。

PBS 洗去通透溶液。在含有 1% BSA 的 PBS 溶 液中孵育细胞，常温封闭细胞 30 min。其目的是封 闭细胞和玻璃片，减少抗体的非特异性吸附，从而减 弱背景。如果仅使用荧光标记的小分子或化合物， 可不进行此步骤。一抗结合。把抗体稀释到含有1% BSA的PBS溶液中，孵育细胞1 h或4 °C过夜。抗体的使用浓度一般为0.1~10μg/mL。由于不同的抗体亲和性和识别能力不同，应根据抗体的性质进行调整。用含有 1% BSA 的PBS 溶液洗涤细胞 3次，每次 5 min，以去除多余的抗体。再使用荧光标记的二抗或染料，稀释在含有 1% BSA 的 PBS 溶液中，室温孵育 1 h。整个过程需要注意避免强光，防止荧光基团的淬灭。再用 PBS 洗涤玻璃片，去除残留的荧光染料或者抗体。*后去掉玻璃片上多余的PBS，并用封片剂封片。待封片剂凝固后，即可进行激光共聚焦显微镜观察。

4 建议

4. 1 荧光表达载体的选择和构建

当对目的蛋白的功能或定位情况了解较少的情况下，可以尝试把荧光蛋白位于目的蛋白的 N 末端或 C 末端。但当目的蛋白上已经存在定位信号或末端存在修饰，需要把荧光蛋白插入到目的蛋白理想的位置，这样可以避免荧光蛋白的插入对蛋白功能或定位产生影响。

由于绿色荧光蛋白存在缺陷，因此 GFP 衍生出许多突变体，使得荧光蛋白变得丰富多彩。因此在设计荧光融合蛋白之前，需要考虑:是否有合适的设备来检测荧光信号? 是否要使用几种不同的荧光蛋白? 荧光融合蛋白是否足够亮? 大部分表达荧光蛋白的克隆载体都已经商业化。其中使用*广泛的商业化的荧光蛋白表达克隆载体，是pEGFP-C1或pEGFP-N1 系列(BD Biosciences Clontech) 。

4. 2 细胞培养和转染

上述生化介导的质粒转染方法是瞬时导入。这种方法使细胞能暂时但高水平表达目的蛋白。一般在转染后 1 ~ 4d 内可获得大量的表达蛋白。此外还有物理方法(电转方法和显微注射)和病毒介导的方法。当细胞用常规方法很难转染(如原代细胞)，或转染试剂的毒性较大，这时可使用显微注射 (microinjection) 的方式将表达载体导入到细胞核中。这种方法对于蛋白质表达水平需要严格控制的实验是比较有用的。

对于活细胞实验，需要实验设备能够维持细胞的生长。显微镜上需要配备合适的热台，可控制一定的 CO2 浓度、合适的湿度和温度等。此外，是否是倒置显微镜? 能否使用高倍镜、油镜或水镜观察细胞? 为了便于成像，一般使用底部为玻璃片的细胞培养皿。由于显微镜并不是无菌的环境，因此对于一般的活细胞实验并不能保证观察过程中无菌，细胞通常在观察后即被丢弃。

4. 3 细胞固定和染色

除了上述使用多聚甲醛固定细胞的方法外，还有一种普遍使用的方法是:培养细胞在 - 20 °C 预冷的甲醇中孵育 5 min。但这种方法对于固定表达荧光蛋白的细胞及 FRET 实验中并不推荐。这是因为:这种处理方法是沉淀细胞内的蛋白，而不是使蛋白质发生交联。此外，为了尽可能减少抗体的用量，可以把玻璃片放置到一层Parafilm 上，然后再把抗体溶液加到玻璃片上。这是利用 Parafilm 的疏水性，使抗体溶液集中到玻璃片上，这样可充分利用抗体溶液，节约抗体。

由于大部分实验都需同时观测两个或多个细胞内的组分，需要对细胞进行多重荧光标记。这时，研究者需要综合考虑实验目的、所使用的激光共聚焦显微镜配置和已有的实验材料。通常，激光共聚焦显微镜配备 4 个激光器(405nm 半导体固体激光器、氩离子激光器、543nm 氦/氖激光器或 561nm半导体固体激光器和633 nm 氦/氖激光器)。405nm 激光器可观察DAPI、Hoechst 和Alexa-405 系列的染料;氩离子激光器可观察 GFP 、CFP 和 YFP 等荧光蛋白，及Alexa-488 和 FITC 等染料;543 nm 和561 nm 激光器可观察 RFP 等荧光蛋白，及Alexa- 546、Alexa-561、Cy3、TRITC 和 Rhodamine 等染料;633nm 激光器可观察 Alexa-647 和 Cy5 等染料。当研究者需要使用上述染料进行多重标记时，要考虑各种抗体的来源，需要使用不同种属来源的抗体进行染色。例如，可使用如下的组合进行细胞标记:DAPI 标记细胞核、GFP 融合蛋白标记目的蛋白、Alexa-561标记抗鼠源抗体和 Alexa-633 标记抗兔源抗体。此外除了使用抗体标记细胞外，还可以使用荧光染料标记的化合物标记细胞内的一些细胞结构和细胞器，如 Phalloidin 标记 F-actin;ER-tracker 标记内质网;Mito-tracker 标记线粒体;Lyso-tracker 标记溶酶体等，这些荧光染料染色同抗体一起组合使用，可使得多重标记变得更容易。

总之，由于生物体内的蛋白存在多样性，在制备免疫荧光样品的过程中应根据蛋白的具体特征，不同的蛋白选择合适的方法，这样才能准确地观察到蛋白质在细胞内的功能和动态变化。