尼康共聚焦显微镜-基础知识
AOTF(Acousto-optical tunable filter )
AOTF,即所谓的声光调制滤光片。通过施加在AOTF上的射频信号,可以选择激光的波长,调节激光的强度。在A1 confocal中,激光器通过AOTF之后进入共聚焦扫描头。
当我们在NIS-Elements软件中选择激光波长和调节激光强度时,就是通过AOTF来实现的。
Binary
Binary即二值化蒙板。在NIS-Elements里面,Binary是用来圈定测量范围的一个工具。
举例来说,我们有如下图像:
通过Threshold工具,我们可以指定一个强度范围(715-4746),所有强度在这个范围之内的像素会被选中,生成一个Binary图层(像素值只有0和1两种数值。0对应的像素不被选中,1对应的像素被选中)。
就像把一张黑纸蒙在原图上,然后在黑纸上挖出一些洞(白色部分),把需要测量的部分露出来。
这样,原图叠加上Binary图层,显示如下:
Binary图层是进行自动测量的基础。
在NIS-Elements中,我们还可以通过Binary Layers工具,对多个Binary进行操作,得到其交集,并集等新的Binary。
Bit Depth
数字图像是由一个个的像素(Pixel)组成的。每个Pixel对应一个灰度值(grayscale),也就是NIS-Elements软件中的强度值(Intensity)。
Bit Depth指的是用几个bit来记录pixel的Intensity。
如果Bit Depth=1,用1个bit来记录Intensity,那么Intensity只能有两种状态(2的1次方):要么是0,要么是1;
如果Bit Depth=2,用2个bit来记录Intensity,则Intensity能有4种状态(2的2次方):0(00),1(01),2(10);3(11);
同理,当Bit Depth=8时,Intensity能有256(2的8次方)种状态,从0到255。
Bit Depth越高,就意味着图像可以记录更丰富的灰度层次,灰度更加细腻,精确。
A1拍摄的图像Bit Depth=12,对应的Intensity有4096(2的12次方)级,从0到4095。
在NIS-Elements的图像窗口右下方信息栏中,我们可以看到当前图像的Bit Depth以及光标处像素的Intensity。
注意:在Windows以及Word,PowerPoint等软件中,支持8bit的图像。所以,如果我们想在windows下直接打开或者在Word等应用程序中插入图像时,需要把12bit的图像转化为8bit。
Cross Talk荧光串色
在进行多通道拍摄时,容易出现荧光串色的现象。
比如,拍摄FITC(绿色)+TxRed(红色)时,
如果同时打开488nm激光和561nm激光,同时拍摄绿色和红色荧光时,FITC的荧光有可能会串到红色通道,对红色通道造成干扰。如下图:
解决方法:
采用Ch Series模式,每次只拍摄一个通道,顺次拍摄。
具体的说,就是:先只打开488nm激光,拍摄绿色通道;然后只打开561nm激光,只拍摄红色通道。
这样就能有效减少荧光的串色现象。
HV(High Voltage)
在A1 confocal中,用来记录荧光强度的设备是PMT(PhotoMultiplier Tube,光电倍增管)。
当荧光分子撞击到PMT靶面后,会转化为光子,光子数经过多级电极之间的放大后输出,再经过特定的转换电路,成为图像中pixel对应的Intensity数值。
当增大PMT的电压HV时,PMT输出的光子数更多,会得到更亮的图像。
但是HV增大会导致图像中噪声的增加。
因此在拍摄时我们要根据标本的实际情况选择合适的HV。
相关信息可以参照“S/N信噪比”词条。
LUT(Look-up Table )
在NIS-Elements软件中,LUT是一种用来调节图像亮度和对比度的方式。
移动左侧黑色三角对应的竖线,通常用来消除背景荧光;
移动右侧白色三角对应的竖线,通常用来增强物镜荧光;
移动斜线上的菱形块,可以改变Gamma值(改变图像对比度的一种方法)。
注意:调节LUT时改变的只是图像的显示效果,并不会改变图像的原始数据,因此是安全的。另外,LUT相关的功能按钮也集成在NIS-Elements的图像窗口,随时可以进行LUT操作(包括在拍摄预览的时候)。
ND拍摄(N Dimensions)
NIS-Elements可以很方便的进行多达6个维度的拍摄。
这些维度包括:
XY :一个平面图像;
Z :空间立体扫描;
T :时间维度。记录标本的动态变化;
入 :波长维度。拍摄多通道图像(注意:这个维度主要用于CCD成像,A1 confocal通常不需要);
M :多视野。可以事先定义好多个视野,同时拍摄这多个视野(注意:需要电动载物台)
nd2文件
nd2文件是NIS-Elements的标准格式。在一个nd2文件中可以同时记录多达6个维度的信息,在查看和分析图像时非常方便。
如下图所示,该nd2文件同时记录了X,Y,T(5个时间点),M(20个视野)以及GFP和DIC两个通道的信息。T和M维度有各自对应的播放区。
除此之外,nd2文件还记录了拍摄时完整的设备信息。比如:定标信息,曝光时间,激光强度……
相关信息可以很方便的进行再现。在拍摄条件需要严格一致的情况下(比如对照实验),再现功能非常有用。
OC(Optical Configuration)
在NIS-Elements软件中,可以把多个设备的特定状态组合起来,生成一个OC按钮。单击该按钮,就可以使仪器快速切换到所需要的状态。
比如:在目镜下观察GFP时,我们需要一系列动作。
1. 关掉透射光光源;
2. 把荧光滤色块转盘转到GFP(或B-2A等)位置;
3. 光路切换到目镜;
4. 打开荧光光源的光闸。
各个部件状态到位之后,我们可以点击生成一个OC按钮,命名为“GFP”。以后只需要点击GFP这个OC按钮,系统就会自动切换到在目镜下观察GFP的状态。
简单来说,OC就是“一键切换”。
OC可以关联的设备包括:
此外,OC还是nd拍摄中Lambda模式的基础。
ROI(Region of Interest)
在NIS-Elements软件中,可以灵活地生成一系列ROI,用于下列操作:
对ROI内图像进行统计,测量;
和Binary结合,一起限定测量的区域;
可以指定为Background ROI,定义背景荧光的强度;
可以指定为Stimulation ROI,定义光刺激区域
……
ROI对应一个独立的图层,可以随时打开或者关闭该图层。
ROI和Binary之间还可以相互进行转化。
S/N信噪比(Signal to Noise Ratio )
信噪比即仪器在采集信号时,信号强度和噪声强度的比率。比如用收音机收听广播时,如果出现“滋滋啦啦”的声音,则说明信噪比比较低。
具体到共聚焦图像上,可以理解为图像上随机出现的杂点的多少。
下面的例子中,左侧图像的信噪比就比较高。
在A1 Confocal拍摄时,PMT的HV设定过高,会出现噪点增加,信噪比下降的现象。因此,在拍摄时要选择合适的HV值。通常设在100左右。
此外,通过Average模式可以有效提高信噪比。