Light Engines——点亮微观世界

2019-09-02 16:01:56 普赫 776

显微镜的出现开启了微观世界的一扇窗,透过这扇微妙的小窗,我们才知窗外还有个如此广袤的世界:大肠杆菌们小手拉大手积极地游走在污染的水质之中;一个小小的细胞原来也是个精密调控的帝国,蓝色的圆鼓鼓的核,绿色的云扇一样的骨架,自发荧光的一颗颗叶绿体,喜欢把自己卷成梭子的线粒体,让这个帝国充满了勃勃生机;然而,基因的损伤或者病毒的掠夺往往让一个正常的细胞迷失了自己,它不受控制地复制自己,排挤曾经志同道合的伙伴,将所有的营养成分据为已有,病理切片下,显微镜足以彰显它的罪恶。然而,这只是这个微观世界的冰山一角,还有很多秘密等着我们去探索。

20X物镜下BPAEC细胞

孔夫子有言,工欲善其事,必先利其器。若想用好显微镜这个利器,让我们先看看点亮这一利器的“原力”——显微镜的光源。

太阳是个光源,小灯泡也是个光源,就连草地上的蠢蠢萤火小虫也可以算是个光源。那么,不同光源之间有什么区别,显微镜的光源又有哪些特殊之处呢?

雨过天晴之后,美丽的彩虹会悬在半空,赤橙黄绿青蓝紫,色彩纷呈。之所以会形成彩虹,主要是由于半空中圆鼓鼓的雨滴对入射的光线发生了折射和反射,使得组成白光的不同波段的单色光分散开来,所以我们可以看到不同色彩的光。通常,小雨滴越大,所形成的彩虹就越鲜亮饱满。入射的光是一条白色的光线,经过小雨滴的分光,色彩就绚丽起来。

在光学上,人们把白光定义为复合光。通常我们见到的光大多是复合光,比如太阳公公发出的光,卤素灯的光,白炽灯的光。如图二所示,人们肉眼可见的光位于400~780nm之间,赤橙黄绿青蓝紫七兄弟在这个波段分属不同的地盘。紫光之外,是紫外,再往下是X射线,γ射线等;红光之外是红外,再往上是微波,无线电波等。

图片来自百度文库

不同光源之间的差异,除了其内在复杂而迥异的发光原理之外,在表型上,则是组成其单色光的强度和频率的差异。显微镜的卤素灯光谱在紫外、可见光以及近红外区域均有分布,光谱特征是在短波段较弱,长波段较强。目前卤素灯光源大有被LED取代的趋势。LED灯又称之为发光二极管,是一种能够将电能转化为可见光的固态半导体器件。卤素灯是将电能转化为热能,由热能进而生成光能,LED就克服了这种限制,可由电能直接转化为光能,所以更为节能。

传统的荧光光源大多是高压汞灯,汞灯工作时需要其内部的汞全部蒸汽化之后才能稳定,汞灯作为激发光源,可以辐射400~700nm的光谱,此外还辐射较强的340nm的长波紫外线。但汞灯的寿命一般较短,数百小时左右,之后整体光强会有所减弱。为了避免频繁的更换,后来又推出了以光纤导入为主的金属短弧灯,发光原理与汞灯类似,但是使用寿命是汞灯的10倍。

汞灯和金属短弧灯均属于气体放电光源,目前一些LED光源也开始逐步占领荧光光源市场。例如Lumencor公司的MIRA,SOLA,SPECTRA X等,下图是SOLA SE与SE FISH的波谱图,在常用生物荧光染料的激发波谱区段均有比较强的荧光输出。

LumencorLED荧光光源使用寿命可以超过20000个小时,操作简单,不像汞灯有开关时间的限制,无需预热,清洁环保。

接下来我们看一下在高端成像产品中崭露头角的单色光——激光。激光是利用激发态粒子在受激辐射作用下发光的电光源,是一种相干光源。激光的单色性好,颜色很纯,光的亮度也很强。那么,这些特点使其在成像方面具有哪些独特的优势呢?

普通光学显微镜是利用可见光对全视野进行照明,即场光源,也就是说它只能对标本局部厚度作平面成像,这样就要求标本要薄,一般是几微米的厚度,而且标本上任何一点的图像都会受到邻近点的衍射光和散色光的影响,所以图像的对比度和分辨率会受到影响。而如果以单色激光作为光源,并用显微镜附设的小孔光阑——针孔使光源成为点光源,与场光源相比,点光源的光源方向性强、发散小、亮度高,可对标本进行左右、上下的扫描来获得厚标本不同层面的图像,可达数百微米。像尼康的激光共聚焦显微镜通常会配备四种常见的激光器405nm,488nm,561nm,和640nm,当然也有其他波段的激光器可以选配。

从明场光到荧光,从复合光到单色光,科技引领进步。与此同时,我们会发现我们对这一“原力”——光,知道的越多,才会发现自己知道的其实很少。

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