如何利用物镜校正立体显微镜中的像差

2018-07-26 15:54:56 Pooher Inc. 184

如何利用正确的物镜校正立体显微镜中的像差

消除液体浸没或嵌入样品/样品的折射率不匹配

对于浸没在液体中或嵌入聚合物中的样品/样品,由于球面像差,可能妨碍高质量的显微镜观察。空气与样品的液体或嵌入介质之间的折射率不匹配是导致图像失真的这种像差的原因  [1]。像差可能使得难以准确地观察样品的某些特征。对于用光学显微镜(立体或复合)观察浸没或嵌入样品的用户,可以校正折射率失配的物镜允许获得具有大大减小的球面像差和更清晰焦点的图像。

背景

立体显微镜具有提高的分辨能力的一个缺点是观察和记录不直接暴露于空气的样品/样品变得更加困难,例如嵌入聚合物(例如电子元件)或浸没在液体中的样品/样品(例如,水生生物)。当观察浸入水溶液中的样品时,样品的精细结构和特征往往看起来模糊,特别是在高放大倍数值下。

这种模糊或图像失真是由球面像差引起的。像差是由空气(n = 1)和水(n = 1.3)的折射率差异引起的,称为折射率不匹配 [1]。有趣或重要的结构很容易被遗漏或忽略,因为立体显微镜的“正常目标”可能会出现球面像差,这些像素被优化用于直接暴露在空气中的样品(无浸没或嵌入介质)。对于使用“z-堆叠”软件功能创建的3D合成图像,像差尤其明显,因为结构在z方向上看起来是细长的。

对于复合显微镜也会出现相同的现象,但是存在液体浸渍化合物物镜,其可以与镜片和样品之间的液体层一起使用。通常,浸没液体是水或油,这些有助于显着减少上述图像像差。

用于立体显微镜的Leica Plan Apo 2x物镜2010年推出。由于有效数值孔径为0.35,它实现了1,050线对/ mm(可见光为952 nm)的分辨率。与早期的显微镜系统相比,这种分辨率的提高部分归功于FusionOptics  [2]FusionOptics技术利用非对称变焦镜头,为立体显微镜用户提供观察样本(通过目镜)的最佳3D感知,并具有最高分辨率和相应的景深。不幸的是,当使用Plan Apo 2x物镜对浸入式或嵌入式介质进行成像时,可能会出现球面像差问题。

用作脊椎动物胚胎发育模型系统的水生生物的研究,如斑马鱼,仍然需要更高的分辨率,更好的光传输和更好的信噪比(S / N)性能。对于具有立体显微镜的荧光应用,这种需求尤其如此。当使用针对暴露在空气中的样品进行优化的这种高分辨率物镜时,在次优条件下观察并记录明显嵌入和浸没的样品以及带有盖玻片的样品。

消除图像像差

存在具有“校正环”的显微镜物镜,其允许调节透镜浸没介质与样品浸没或嵌入介质之间的折射率的不匹配。校正环的调整导致物镜内的一组透镜的位置发生偏移。目标项圈如何校正折射率不匹配的说明如图1所示。

物镜的校正环使用户能够消除球面像差并获得嵌入(聚合物或玻璃)或液体浸入(水)样品/样品的图像,具有更清晰,更清晰的焦点。在校正与物镜轴的折射率不匹配之后,似乎不存在浸没或嵌入介质。适当调整物镜校正环提高了空间分辨率和图像的S / N比。

具有校正环的立体显微镜物镜的示例是Leica Plan Apo 2x Corr物镜。使用Leica Plan Apo 2x Corr,即使是厚的嵌入样品或浸入深水溶液(5 mm)中的样品也可以成像很少或没有像差。 

奥林巴斯显微镜|奥林巴斯生物显微镜|奥林巴斯金相显微镜|奥林巴斯倒置显微镜|OLYMPUS显微镜|上海普赫光电科技有限公司官网 

1:浸没或嵌入的样品/样品的显微镜观察; 通过光学系统追踪光线(黄色)(蓝色虚线是光轴)。
- 未校正的情况:样品浸入/嵌入介质与空气之间的折射率不匹配导致球面像差和图像沿垂直方向的伸长  [1]
- 校正情况:能够调整折射率失配的物镜可以在很大程度上消除像差。

应用实例

许多用户使用立体显微镜检查或记录嵌入式和液体浸没的样品/样品。以下示例演示了使用具有Leica 2x Plan Apo Corr物镜的立体显微镜时的图像质量改善(假设正确设置和调整)。

样品/样品浸入水溶液中

牛肺动脉内皮(BPAE)细胞被用作心血管功能和疾病研究的模型系统  [3]。使用荧光FluoCells牛肺动脉内皮(BPAE)图像细胞®,的MitoTracker ®红,CMXRos,BODIPY ® FL phallacidin和DAPI(分子探针,莱顿,荷兰)在图2中看到他们用获得的徕卡M205 FA立体显微镜,Leica 2x Plan Apo物镜或Leica 2x Plan Apo Corr物镜,Leica DFC3000G数码相机LAS X软件

在图2A中,仅具有phallacidin通道的荧光图像和用Leica 2x Plan Apo物镜(无校正环)捕获的明视场图像。该BODIPY ®  FL phallacidin污渍选择性的F-肌动蛋白丝。获取图像Z-堆栈并显示每个堆栈的最清晰图像。没有应用图像处理算法,因此这些图像显示原始数据。

在图2B中,使用Leica 2x Plan Apo Corr物镜捕获图像,其中校正环设定为0.25mm以补偿包埋介质和盖玻片。通过在略微不同的设置下目视观察和比较用校正环获得的一系列Z-堆叠来识别校正环的最佳位置。图像清楚地显示了校正环上的正确设置对图像质量的差异。细胞中的肌动蛋白丝结构变得更加可见并且S / N比得到改善。与大多数类型相比,BPAE细胞样本非常薄。

奥林巴斯显微镜|奥林巴斯生物显微镜|奥林巴斯金相显微镜|奥林巴斯倒置显微镜|OLYMPUS显微镜|上海普赫光电科技有限公司官网 

2:A:用盖玻片嵌入载玻片上并用Leica M205 FA立体显微镜捕获的BPAE细胞的荧光图像,其中使用没有校正环的2x Plan Apo物镜。细胞中的肌动蛋白丝(红色箭头)是可见的,但看起来模糊。在细胞边界处还有轻微的模糊(白色箭头)。B:使用具有校正环的Leica 2x Plan Apo Corr物镜的相同样品。肌动蛋白丝(红色箭头)变得更加明显。细胞边界处的模糊(白色箭头)显着减少。核中的结构可以更好地分辨。

较厚的样本可以看到更大的效果,例如斑马鱼的幼虫浸入深达数毫米的水溶液中  [4]。下面的视频(图3)是用Leica M165 FC立体显微镜,Leica 2x Plan Apo物镜或Leica 2x Plan Apo Corr物镜和Hamamatsu Orca-R2数码相机获得的。斑马鱼幼虫在其血管中表达绿色荧光蛋白(GFP)。

 

3:表达绿色荧光蛋白(GFP)的斑马鱼幼虫浸没在水溶液中的荧光视频成像。使用Leica M165 FC立体显微镜捕获图像,其中使用具有(右图像)和不具有(左图像)校正环的Leica 2x Plan Apo物镜。在两个视频中看到斑马鱼幼虫的心脏跳动。幼虫在右侧的未校正图像中显得模糊。由M. J. Hamm和W. Herzog提供,血管生成实验室,Max Planck分子生物医学研究所和德国明斯特的WestfälischeWilhelms大学。

样品嵌入聚合物中

市售的发光二极管倾向于嵌入聚合物中以供实际使用。嵌入聚合物中的LED的图像显示在图4中。它们是用Leica M205 FA立体显微镜,Leica 2x Plan Apo物镜或Leica 2x Plan Apo Corr物镜,DFC450数码相机和LAS X软件获得的

在图4A中,使用Leica 2x Plan Apo物镜(无校正环)捕获的明场图像。可以看到LED的各个部分。获取图像Z-堆栈并显示每个堆栈的最清晰图像。没有应用图像处理算法,因此这些图像显示原始数据。

在图4B中,使用Leica 2x Plan Apo Corr物镜捕获图像,其中校正环设置为2 mm以补偿塑料。如前所述,通过在略微不同的设置下目视观察和比较用校正环获得的一系列Z-堆叠来识别校正环的最佳位置。可以看到图像质量的明显差异。LED段聚焦清晰,S / N比提高。

奥林巴斯显微镜|奥林巴斯生物显微镜|奥林巴斯金相显微镜|奥林巴斯倒置显微镜|OLYMPUS显微镜|上海普赫光电科技有限公司官网 

4:A:嵌入聚合物中的LED的明场图像,其使用Leica M205 FA立体显微镜捕获,其中使用没有校正环的Leica 2x Plan Apo物镜。各个LED段可见,但看起来很模糊。B:使用具有校正环的Leica 2x Plan Apo Corr物镜的相同样品。LED部分现在更清晰,更清晰。模糊显着减少。

概要

由于空气与样品或样品的液体或嵌入介质(例如聚合物)之间的折射率不匹配而导致的球面像差会降低显微镜观察的质量  [1]。观察期间样品的特定特征可能会变形。用于观察浸入或嵌入样品的光学显微镜(立体或复合)用户可以通过使用校正折射率失配的物镜来避免像差和图像失真。

 


邮箱咨询
QQ咨询
在线咨询
电话咨询