奥林巴斯透射暗场显微镜介绍

2018-05-25 16:20:12 Pooher Inc. 393

尽管距离地球有很大的距离,但我们所有人都非常熟悉黑夜中恒星的外观和能见度。夜晚的星星可以很容易地观察到,主要是因为它们微弱的光线和黑色天空之间的鲜明对比。

奥林巴斯显微镜|奥林巴斯生物显微镜|奥林巴斯金相显微镜|奥林巴斯倒置显微镜|OLYMPUS显微镜|上海普赫光电科技有限公司

然而,恒星日夜都在闪烁,但它们在白天是不可见的,因为太阳的压倒性亮度会“遮蔽”来自恒星的微弱光线,使它们看不见。在日全食期间,月球在地球和太阳之间移动,阻挡了太阳的光线,即使是白天,现在也可以看到星星。简而言之,昏暗的星光在黑暗背景下的可见度大大提高。

该原理在暗场(也称为施加darkground显微镜法,用于制造的简单且常用的方法未染色的透明标本清晰可见。这样的物体通常具有非常接近其周围环境的折射率,并且在传统的明场显微镜中难以成像。例如,许多小水生生物的折射率范围为1.2至1.4,与周围的水性介质的光学差异可以忽略不计。这些是暗场照明的理想选择。

暗场照明需要阻挡通常通过并围绕(围绕)样品的中心光线,只允许来自每个方位角的倾斜光线“撞击”安装在显微镜载玻片上的样品。简单阿贝暗场聚光镜的顶部透镜呈球形凹面,允许从所有方位角的表面出射的光线形成一个倒置的空心光锥,其顶点位于样品平面的中心。如果没有试样,并且聚光器的数值孔径大于物镜的数值孔径,则倾斜的光线会交叉,并且由于它们的倾斜度,所有这些光线将错过进入目标。视野将显得很暗。

图1所示的暗场聚光器/物镜对是一种高数值孔径排列,它表示最复杂配置下的暗场显微镜,这将在下面详细讨论。物镜包含一个内部虹膜光阑,用于将物镜的数值孔径降低到低于冷凝器发射的倒空中空光锥的值。心形聚光镜是一种反射式暗场设计,依靠内部反射镜将无像差光锥投射到样品平面上。

当标本放置在载玻片上,尤其是未染色的,不吸光的标本时,倾斜的光线穿过标本并被光学不连续性(例如细胞膜,细胞核和内部细胞器)衍射,反射和/或折射)允许这些微弱的光线进入目标。然后可以在另外的黑色背景上看到标本明亮。就傅立叶光学而言,暗场照明从物镜后焦平面处形成的衍射图案中消除零级(未散射光)。这导致仅由来自试样的高阶衍射强度形成的图像。

奥林巴斯显微镜|奥林巴斯生物显微镜|奥林巴斯金相显微镜|奥林巴斯倒置显微镜|OLYMPUS显微镜|上海普赫光电科技有限公司

图2中的显微照片显示了暗场和明场照明对整个装载标本中来自小型海洋原生动物(放射虫)的二氧化硅骨架的影响。在普通的明视野中,放射虫的骨骼特征没有明确定义,并且在用传统胶片或数字捕获记录的显微照片中倾向于被冲刷掉。图2(a)中的显微照片是在明场照明下拍摄的,聚光器孔径光阑关闭到衍射伪影模糊一些样本细节的点。这会增加标本的对比度,但会造成图像失真。在暗场照明下(图2(b)),存在更多细节,特别是在生物体的上部,图像获得明显的三维外观。

具有光滑反射表面的样本会产生图像,部分原因是光线反射到物镜中。在折射率与周围介质不同或发生折射率梯度的情况下(如在膜的边缘),光被样品折射反射和折射的这两种情况在光的方向上产生相对小的角度变化,允许一些进入物镜。相比之下,一些撞击试样的光也会被衍射,产生穿过物镜的整个数值孔径范围的180度弧光。目标的分辨能力与在明场条件下观察到的暗场照明相同,但图像的光学特性不如忠实再现(除非使用专门设计的虹膜光阑来降低有效数值孔径,放大的油浸物镜,专门设计用于暗场显微镜)。

就像上面描述的星光的例子那样,明亮的闪烁标本和黑暗环绕之间的对比度大大提高了能见度。如上所述,在暗场照明中发生的情况是,所有通常没有照射的零级光线都被不透明光圈挡住了。现在由样品衍射并在物镜的后焦平面产生第一,第二和更高衍射级的倾斜光线前进到像平面,在那里它们相互干涉以产生样品的图像。

暗场照明的理想候选者包括微小活水生生物,硅藻,小昆虫,骨头,纤维,毛发,未染色的细菌,酵母,组织培养中的细胞和原生动物。非生物标本包括矿物和化学晶体,胶体颗粒,灰尘计数标本,以及包含小夹杂物,孔隙度差异或折射率梯度的聚合物和陶瓷薄片。准备用于暗场显微镜的样本时应小心,因为位于聚焦平面上方和下方的特征也会散射光线并导致图像退化。样品厚度和显微镜载玻片厚度也是非常重要的,一般来说,薄样品是可取的,以消除可能干扰图像形成的衍射伪影的可能性。

奥林巴斯显微镜|奥林巴斯生物显微镜|奥林巴斯金相显微镜|奥林巴斯倒置显微镜|OLYMPUS显微镜|上海普赫光电科技有限公司

图3所示的下级冷凝器展示了通过简单折射冷凝器的不透明光阑对光路的影响。在左边(图3(a)),是一个典型的阿贝明场聚光器,其孔径光阑打开,以使光锥的数值孔径最大化。来自光源的光线通过孔径光阑,然后通过几个透镜元件折射形成数值孔径约为1.20的倒锥形光线。当一个不透明的蜘蛛式光阑(图3(b))插入完全打开的孔径光阑的下方时,中心光线被阻挡,仅允许外围光线通过透镜形成一个倒置的倾斜空心光锥数值孔径没有变化(1.20)。照明空心光锥通过在透镜元件的周边折射光而形成,其中光学校正通常是最差的。即便如此,这款聚光镜还是可以充分发挥低放大倍率的物镜的作用,并且能够为黑暗的质感工作带来非常好的效果。对于更精确的定量显微镜,有必要使用平面聚光镜(对色差和球差进行校正),通过生成具有更清晰细节和更可靠特征的图像,性能更佳。

在暗视野显微镜中,如果您要通过Bertrand镜头或相位望远镜观察物镜的背面,它会显得充满光线。这种微弱的衍射光在目镜光阑的平面处重新组合成可见图像,其对比度在黑色背景上反转,明亮的图像。由于暗视野显微镜消除了明亮的未照明光线,因此这种照明形式非常浪费光线,因此需要高强度照明光源。显微镜载玻片必须具有合适的厚度,约为1毫米+/- 0.1毫米。样本载玻片和光路中的所有光学表面必须严格清洁,因为每个污垢斑点都会无情地变亮。

有几件设备用于制造暗场照明。最简单的是位于底下聚光镜底部透镜(前焦平面)下方的“蜘蛛挡板”(图3(b)和4(a))。光圈和视场光阑都打开很大,以通过倾斜光线。中央不透明的光阑(可以通过在透明玻璃盘上安装一枚硬币来制作)阻挡中心光线。即使使用阿贝聚光镜(图3),该装置也能很好地工作,10倍物镜的数值孔径不超过0.65,物镜达到40倍或更高。不透明光阑的直径应为大约16-18毫米,对于数值孔径的10倍物镜为0.25至大约20-24毫米,对于数值孔径接近0.65的20x和40x物镜。

图4(a)所示的一组止动器的尺寸从8毫米到30毫米不等,并且为几乎任何数值孔径物镜(低于0.65)提供优异的暗场不透明止挡。简单地通过移除支撑蜘蛛底部的螺钉并用新尺寸替换止动件,可以互换单个止动件。蜘蛛架的外部尺寸将根据冷凝器底部的外壳开口直径而变化。

图4(b)所示的光阑是一种巧妙的装置,它利用杠杆控制臂来扩大和收缩“反向光阑”光阑以增加或减小光阑的尺寸。当这个杠杆被转动时,中心叶片的尺寸从大约10毫米变为直径25毫米,从而为更高放大倍率物镜创造更大的阻挡。每次将较高功率的物镜插入光路时,这种类型的可变光阑可避免更换光阑。它还具有“可调”的附加优点,因为在观察样品的同时获得最佳性能所需的光阑直径的细微差异。虽然这些类型的光圈光圈现在非常少见,

奥林巴斯显微镜|奥林巴斯生物显微镜|奥林巴斯金相显微镜|奥林巴斯倒置显微镜|OLYMPUS显微镜|上海普赫光电科技有限公司

几乎所有的明场实验室显微镜都可以轻松转换成暗场照明。如上所述,中央不透明挡块可以由小硬币,纸板,塑料或黑纸制成,可以放置在冷凝器下方的过滤器载体中(或用胶带粘贴到冷凝器底部)以阻止光进入目标的前镜头。不透明光阑的直径因物镜而不同,因此应仔细测量,方法是在透明底座上放置一个透明标尺,并将其稳定地靠在冷凝器的底部。接下来,通过移除目镜确定开口尺寸,并使用相位望远镜(或通过插入伯特兰透镜)观察物镜后焦平面上的标尺图像。确保在执行该操作之前,底座聚光器孔径和现场光阑都打开到最宽的位置。在后焦平面中可见的标尺分割数量将等于阻止零级光线进入物镜所需的光阑尺寸。更改为下一个最大尺寸的目标,并进行另一次测量,重复,直到所有目标的停止尺寸已知。

表1中给出了近似不透明光圈大小与放大倍数的指南。实际大小取决于多种因素,包括光圈相对于聚光器孔径光阑的接近度,物镜和聚光器的数值孔径,聚光器的像差校正程度以及目镜的场数。确定光圈尺寸的重要因素还包括聚光镜后部透镜的直径,目镜的放大倍率(较小的放大倍数需要稍大的光圈)以及安装介质的类型。光阑尺寸与安装介质的折射率成比例地变化:较高的折射率需要较大的光阑。干式固定座也需要比水性悬浮液更小的止挡。

Approximate Field Stop Diameter Size
MagnificationNumerical
Aperture
Stop Size (mm)
1X0.0325-30
2x0.058-11
4X0.108-14
10x0.2516-18
20X0.4018-20
20x0.6520-22
40X0.6522-24
表格1

用剪刀或(最好是)黄铜软木塞钻切一组与所有物体相匹配的挡块,然后将它们粘在一块坚固的透明乙酸酯或玻璃上。醋酸纤维或玻璃基板应该可以通过过滤器支架或其他方式(如胶带)方便地安装到底座冷凝器的下侧。可以通过观察Bertrand透镜或取下目镜并通过相位望远镜进行观察,同时调整聚光镜对中螺丝来完成光圈的对准。

高倍放大的暗场显微镜

对于更精确的工作和更黑的背景,您可以选择专门为暗场设计的聚光镜,即仅传输倾斜光线。有几种类型:“干燥”暗场冷凝器,冷凝器顶部与滑块底部之间存在空气 - 以及浸没式暗场冷凝器,这些冷凝器需要使用一滴浸油(有些设计为使用水来代替)冷凝器顶部与载玻片下侧接触浸入式暗场聚光镜具有内部镜像表面,并通过倾斜度大且无色差的光线,产生最佳结果和最黑暗背景。

也许最广泛使用的暗场聚光器是抛物面,由一块非常精确地抛物面抛物面的固体玻璃组成,如图5(b)所示。入射到抛物面聚光器反射面(图5(b)中的玻璃和聚光器外壳之间)的光将聚焦在反射器的焦点处。大多数抛物面聚光镜被切割,以确保焦点略微超出聚光镜的顶部,以便平行光线聚焦在最大化样品照明的位置。玻璃冷凝器底部的光阑用于阻挡中心光线到达样品。由冷凝器反射的光线的角度高于临界反射角并聚集在冷凝器的主焦点处。

奥林巴斯显微镜|奥林巴斯生物显微镜|奥林巴斯金相显微镜|奥林巴斯倒置显微镜|OLYMPUS显微镜|上海普赫光电科技有限公司

如上所述,干暗场冷凝器可用于数值孔径小于0.75(图5(a))的物镜,而抛物面和心形的浸入式电容器(图1和5(b))可用于数值非常高的目标光圈(最高1.4)。数值孔径大于1.2的物镜需要减小其工作孔径,因为它们的最大数值孔径可能会超过聚光镜的数值孔径,因此允许直射光进入物镜。出于这个原因,许多设计用于暗场和明场照明的高数值孔径物镜都是通过内置可调虹膜光阑实现的,该虹膜光阑用作光圈。数值孔径的这种减小也限制了物镜的分辨能力以及图像中光的强度。专门设计用于暗场作业的专用物镜的最大数值孔径接近暗场聚光器数值孔径的下限。它们没有内部光圈,但是镜头座的直径是经过调整的,所以至少有一个内部镜头有最佳直径作为孔径光阑。

表2列出了最常见的反射高数值孔径暗场聚光器的几个特性。在选择用于高数值孔径暗场应用的冷凝器/物镜组合时,应使用该表作为指导。

High Numerical Aperture Darkfield Condenser Specifications
Condenser TypeHollow Cone
Numerical Aperture
Objective Maximum
Numerical Aperture
Number of Reflecting
Surfaces
Optical Corrections
Paraboloid1.00-1.400.851 ParabolicAchromatic
Cardioid1.20-1.301.051 Spherical
1 Cardioidal
Achromatic/
Aplanatic
Bicentric1.20-1.301.051 Cardioidal
1 Spherical
Aplanatic
Bispheric1.20-1.301.052 SphericalAplanatic
Cassegrain1.40-1.501.301 Aspheric
1 Spherical
Aplanatic
Spot Ring
(Bicentric)
1.40-1.501.302 SphericalAplanatic
Nelson
Cassegrain
1.30-1.451.201 Aspheric
1 Spherical
Aplanatic
表2

图5所示的电容器专门设计用于为暗场照明产生高数值孔径的倾斜空心光锥。在这两种情况下,聚光器的上表面都是平面的并垂直于显微镜的光轴。左侧冷凝器(图5(a))设计为在冷凝器和显微镜载玻片下侧之间没有油的情况下“ 干燥 ”使用。相反,图5(b)中的抛物面聚光器用于“ 上油”“到显微镜载玻片的底部,直接在样品的下面,当使用该冷凝器(或表2中列出的任何其它冷凝器)时,排除浸没油将阻止任何光到达样品,光线的倾斜空心圆锥由这些聚光器发出的光不能从没有油的顶部透镜出射,并且将被全部反射回聚光器。从照明源发出的光在聚光镜内部的镜面玻璃表面反射并远离冷凝器的顶部倾斜角大于发生全反射以使光从玻璃通向空气的临界角(约41度)。在冷凝器玻璃,浸没油和载玻片的折射率相等的情况下,从冷凝器发出的光穿过没有被折射的样品的被冷却的抛物面冷凝器(图5(b)和表2中的冷凝器)玻璃 - 空气界面。

表2列出的反射式高数值孔径聚光器涵盖了用于生产高放大率暗场显微镜所需的倾斜空心光锥的各种设计。上面已经详细讨论了抛物面暗场聚光镜。另一个非常有用的设计是图1所示的心形聚光器。该聚光器设计在聚光器中心采用了一个镜面半球体,该半球体既用作光阑,又用作反射器,以将光线导向第二反射表面,形成类似革命心型,冷凝器从中得到它的名字。球面和心形反射面的组合产生一个没有彗差和球面和色差的聚光器。使用这种高数值孔径的聚光器存在几个技术缺陷。心型聚光器对准非常敏感,必须小心放置以利用非常尖锐的照明锥体,使其成为最难使用的暗场聚光器。此外,冷凝器会产生大量的眩光,即使是最微小的灰尘颗粒也会产生眩光,并且短焦距可能导致尺寸或厚度超过几微米的物体的照明效果差。当选择用于定量高倍率暗场显微镜的显微镜载玻片时,确保选择由不含荧光杂质的玻璃混合物制成的载玻片。心型聚光器对准非常敏感,必须小心放置以利用非常尖锐的照明锥体,使其成为最难使用的暗场聚光器。此外,冷凝器会产生大量的眩光,即使是最微小的灰尘颗粒也会产生眩光,并且短焦距可能导致尺寸或厚度超过几微米的物体的照明效果差。当选择用于定量高倍率暗场显微镜的显微镜载玻片时,确保选择由不含荧光杂质的玻璃混合物制成的载玻片。心型聚光器对准非常敏感,必须小心放置以利用非常尖锐的照明锥体,使其成为最难使用的暗场聚光器。此外,冷凝器会产生大量的眩光,即使是最微小的灰尘颗粒也会产生眩光,并且短焦距可能导致尺寸或厚度超过几微米的物体的照明效果差。当选择用于定量高倍率暗场显微镜的显微镜载玻片时,确保选择由不含荧光杂质的玻璃混合物制成的载玻片。并且短焦距可能导致尺寸或厚度超过几微米的物体的照明效果差。当选择用于定量高倍率暗场显微镜的显微镜载玻片时,确保选择由不含荧光杂质的玻璃混合物制成的载玻片。并且短焦距可能导致尺寸或厚度超过几微米的物体的照明效果差。当选择用于定量高倍率暗场显微镜的显微镜载玻片时,确保选择由不含荧光杂质的玻璃混合物制成的载玻片。

奥林巴斯显微镜|奥林巴斯生物显微镜|奥林巴斯金相显微镜|奥林巴斯倒置显微镜|OLYMPUS显微镜|上海普赫光电科技有限公司

具有暗场照明的高数值孔径反射聚光镜(图1,5,6和表2)提供了用于观察和拍摄极小颗粒或胶体悬浮液集合的选择方法,即使当颗粒直径明显低于分辨率极限时为目标。这是由于被粒子衍射的光,其通过物镜并且作为明亮的衍射盘变得可见。如果相邻粒子之间的横向距离大于物镜分辨能力的极限,则每个粒子都可以看作是一个微小的衍射盘。随着照度增加,微小衍射粒子与其背景之间的光学差异增大。同时,甚至更小的颗粒(仅凭其散射光的能力可检测到)现在衍射出足够的光线以变得可见,并且即使当它们的直径小于40纳米时也可以看到悬浮颗粒,这是石油浸没时约为200纳米分辨率极限的五分之一最高数值孔径的目标。在生物应用中,可以观察到直径约20纳米(太小而不能在明场或DIC照明中看到)的活细菌鞭毛的移动,并使用高数值孔径暗场冷凝器进行拍照。这是最高数值孔径油浸目标的约200纳米分辨率限制的五分之一。在生物应用中,可以观察到直径约20纳米(太小而不能在明场或DIC照明中看到)的活细菌鞭毛的移动,并使用高数值孔径暗场冷凝器进行拍照。这是最高数值孔径油浸目标的约200纳米分辨率限制的五分之一。在生物应用中,可以观察到直径约20纳米(太小而不能在明场或DIC照明中看到)的活细菌鞭毛的移动,并使用高数值孔径暗场冷凝器进行拍照。

应仔细注意将高数值孔径聚光器注入载玻片底部的细节。避免在冷凝器顶部透镜和显微镜载玻片底部之间的区域引入微小的气泡是非常困难的,并且应该实施这种技术以达到完美。气泡会导致图像闪烁和失真,导致对比度下降和整体图像质量下降。使用显微镜载片太厚或太薄时也会遇到问题。许多暗场冷凝器包含直接刻在冷凝器支架上的可用滑块厚度范围。如果载玻片太厚,通常很难聚焦冷凝器而不采用更高粘度的浸油。另一方面,太薄的滑块有破坏冷凝器和滑板之间的油粘合的趋势。购买正确厚度的精密显微镜载玻片是一个好主意,以避免上述任何问题。

当使用高数值孔径暗场冷凝器对浸在水性介质中的标本进行成像时,会出现一种独特的情况。在这些条件下,水溶液的折射率限制了光线从玻璃载玻片(n = 1.515)进入样品周围水(n = 1.336)的倾斜角度从玻璃到水的光的最大数值孔径由下式给出:

NA(照度)= 1.555×sin(i)= 1.336×sin(90°)

并因为sin(90°)= 1

NA(照度)= 1.336

尽管设计用于油浸的反射式暗场冷凝器的数值孔径的上限高达1.50(参见表2),但有助于在含水介质中照射试样的光必须具有不大于1.336的数值孔径,从而降低了有效性暗场照明的上限。在试样浸入较高折射率液体的情况下,暗场照明的数值孔径的有效上限可以接近最大值1.50,尽管这在实践中很难实现。

高数值孔径聚光镜,无论是干式还是油式,都必须在显微镜的光路中精确居中以实现最佳性能。为了达到这个目的,许多暗场冷凝器的上表面刻有一个小圆圈,以帮助对中冷凝器。使用低功率(10x-20x)物镜进行定心,通过对雕刻圆圈进行成像并使用聚光镜定心螺丝确保圆形(和聚光镜)在光路中正确对中。有关暗场照明的显微镜对准的更多详细信息,请参阅我们关于显微镜底层中其他位置暗场显微镜配置的部分

一般来说,在暗视野照明的适当条件下成像的物体是非常壮观的(例如,在暗场中尝试一滴新鲜血液)。通常在明场显微镜中含有非常低的固有对比度的样品在黑暗场地中闪闪发光。这种照明最适合揭示轮廓,边缘,边界和折射率梯度。不幸的是,暗场照明在揭示内部细节方面不太有用。

奥林巴斯显微镜|奥林巴斯生物显微镜|奥林巴斯金相显微镜|奥林巴斯倒置显微镜|OLYMPUS显微镜|上海普赫光电科技有限公司

其他类型的样本,包括许多染色的样本,在暗场条件下对照明也有很好的反应。图7显示了三种类型样品的暗场显微照片,所有这些在明场和暗场照明中均产生良好的对比度。图7(a)所示的鹿蜱体内的细节可以在明视野中清除,除非聚光器光圈停止下来以最大化对比度。然而,在黑暗场地中,蜱中的大部分标本细节都可以看到,并且可以很容易地拍摄到胶片上。重度染色的蠕虫吸虫(Echinostoma revolutum,图7(b))在黑暗条件下照明时也显示出更多的细节,如图7(c)所示的蚕气管和气孔。除了上面介绍的例子之外,还可以在明场和暗场照明下观察和拍摄多个其他标本,以达到所需的效果。

在20世纪上半叶,暗场显微镜具有非常强大的跟踪力,并且在优化暗场冷凝器和照明器方面付出了很多努力。随着相位对比,微分干涉对比和霍夫曼调制对比等更先进的对比增强技术的出现,这种强烈的兴趣逐渐淡化。近来,由于其与荧光显微镜结合使用时的优点,对透射暗场显微镜的重新兴趣已经出现

暗场显微镜仍然是生物学和医学研究的绝佳工具。它可以在高放大率下有效地用于拍摄活细菌,或者在低放大倍数下查看和拍摄细胞,组织和整个坐标。海洋生物学家继续以低功率使用暗场照明来观察和记录有关淡水和咸水生物如藻类和浮游生物的数据。

注意:这篇文章是由无人工介入的谷歌自动的机器翻译软件翻译完成。我们很高兴能同时提供给您由人工翻译的和由机器翻译的文章, 以使您能使用您的语言访问所有的知识库文章。然而由机器翻译的文章并不总是完美的。它可能存在词汇,语法或文法的问题,就像是一个外国人在说中文时总是可能犯这样的错误。虽然谷歌经常升级机器翻译软件以提高翻译质量,但是我们不保证机器翻译的正确度,也不对由于内容的误译或者客户对它的错误使用所引起的任何直接的, 或间接的可能的问题负责。

查看原始的英语文章:Darkfield Illumination


邮箱咨询
QQ咨询
在线咨询
电话咨询