徕卡共聚焦显微镜——科研中的尖兵利器浅析

与传统的宽场成像相比，共聚焦作为一种高端的显微成像术，以其出色的成像质量及三维重构能力，俨然已成为一种主流的成像方式。接下来小编将带你进入共聚焦的世界，为你浅析共聚焦的基本原理及其在生物研究领域的应用。

共聚焦原理

激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）利用放置在光源（激光）后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔（pinhole）实现点照明和点探测，光源通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔内，焦平面以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。因此，通过共聚焦能够清晰地获得焦平面上的荧光信号。

图1 左右两边分别是普通宽场显微镜和共聚焦显微镜的成像光路，共聚焦显微镜利用点探测和点照明技术获得高清晰度的图像。

计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。随着载物台沿Z轴上下移动，样品的新层面又成像在显示器上，这样就可得到样品不同层面的连续光切图像(Z-stack)，进一步通过三维重构就能获得样品精确的三维信息。

图2 左：共聚焦显微镜的点扫描及Z轴层切模式；右：通过共聚焦显微术对视网膜神经元进行三维重构。

共聚焦应用

相对于普通宽场成像，共聚焦能获得高分辨率高清晰度的三维图像，因此其应用范围更广，接下来小编将介绍共聚焦显微镜在生物研究领域的几点重要应用。

激光共聚焦显微镜*重要的应用莫过于荧光定位的观察与三维重构。通过荧光定位观察可以得知感兴趣的蛋白在细胞或组织中的定位情况，而结合对细胞器或细胞骨架等结构进行标记可以得到该蛋白的亚细胞定位，通过与其他蛋白进行双色或多色共染可以分析两个或多个蛋白的共定位情况。

图3 左: 通过共聚焦显微镜对细胞微丝骨架（绿色，phalloidin）及线粒体（红色，mitrotracker）结构的清晰成像；右：通过共聚焦显微镜对果蝇卵结构的三维重构。

共聚焦通过点扫描对样品进行成像，通过不断移动Z轴实现对样品的三维层切并通过三维重构获得样品精确的三维信息（被称为“细胞 CT”），进而可以更准确地在Z轴上分析蛋白的定位情况。

如果你要对样品的荧光信号进行定量，那么通过徕卡共聚焦显微镜操作软件可以轻松达到这一目的，操作简便快捷。

图4 通过共聚焦软件对荧光信号进行定量：选中quantify-intensity-stack profile选项，通过ROI工具框选待分析区域，在窗口中间即显示所选区域的所有信息，包括荧光通道、平均荧光

如果你要对两个或多个信号进行共定位分析，我们的软件也应对自如。

图5 通过共聚焦软件对荧光信号共定位情况进行分析：选中quantify-colocalization选项，通过ROI工具框选待分析区域，在窗口中间即显示所选两个通道的共定位参数，包括Pearson系数、共定位比率等。

假如你的样品需要拍摄大视野而同时又需要高分辨率怎么办呢?不用着急，我们的软件里有自动拼图功能，你只需要设置好所拍摄视野对角线上的两个端点，软件便会自动进行运算并进行自动拼图拍摄。同样的，如果你不需要拼图，仅需要拍摄多点，我们的软件也可以轻松帮你实现。

图6自动拼图（左）和多点成像（右）模式。

图7 对小鼠鼻腔层断面的大视野高清晰度拼图。左：48个视野的自动拼图（40倍物镜），右：对左图中框选区域的放大。

共聚焦不仅能对固定样品进行成像，对活细胞或组织样品进行成像也是小菜一碟，只要你设置好相关参数就可以轻松拍摄了。当然，活体拍摄过程中维持样品活性的条件是要保证的，如细胞培养的温度、湿度及二氧化碳浓度等，这都可以通过选择共聚焦显微镜相关配件轻松实现。这样你就可以通过活体拍摄追踪细胞增殖、细胞运动、细胞骨架动态变化、细胞内钙离子信号变化等生命过程了。

视频1 对COS7细胞中微管结构进行共聚焦活体成像，共拍摄5分钟，时间间隔5秒。

（Courtesy: Dr. Yasushi Okada, University of Tokyo）

a . 光谱测量

在开发新的荧光蛋白/染料或对植物叶片等自发荧光较强的样品成像时，荧光蛋白/染料的激发和发射光谱就显得尤其重要。通过共聚焦这一利器能轻松实现对荧光蛋白/染料发射光谱的扫描，而配备*新的白激光激光器后，荧光蛋白/染料激发和发射光谱的同时扫描在分分钟内就能轻松搞定。

图8 通过白激光激光器对六色荧光小球样品激发和发射光谱的同时扫描。

b .  FRAP

（Fluorescence Recovery After Photobleaching）

借助于高强度激光照射细胞的某一区域使该区域荧光分子发生光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，用激光扫描共聚焦显微镜可直接对此扩散速率进行检测，由此可以研究生物膜流动性、细胞骨架动力学、细胞内及细胞间的物质交流等。

图9 荧光漂白恢复技术（FRAP的实现过程。

c . FRET

（Förster resonance energy transfer）

荧光共振能量转移发生在供体荧光分子与受体荧光分子的距离足够近且供体的发射光谱与受体的吸收光谱相重叠时（10nm以内）。当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过共振实现能量向邻近受体分子转移的现象。发生FRET后，供体的荧光强度比它单独存在时要低的多，而受体发射的荧光却大大增强。通过FRET可以检测分子间的相互作用及分子的折叠与构象变化。

图10荧光共振能量转移技术（FRET）的原理。

以上高级功能的应用都可通过选择拍摄软件中的相应模块快速的实现。

小结

共聚焦显微镜作为科研中的尖兵利器，其应用还远不止上面提到的这些。而徕卡新一代顶级共聚焦显微镜Leica TCS SP8 X配备了白激光激光器（**的AOBS分光系统）、棱镜分光狭缝检测系统、AFC自动对焦装置、*高灵敏检测器HyD（配合白激光可实现高清晰度高分辨率的门控成像）、Hyvolution图像处理软件（通过反卷积处理可达到130nm高分辨率）等，能轻松实现以上所有应用。同时，其**的扩展性使SP8能轻而易举升级为STED*高分辨率显微镜、MP多光子成像系统、Hi speed高速扫描系统等进而实现更多更**的应用，可以说SP8 X共聚焦显微镜作为科研界的尖兵利器当之无愧。