课堂 | Leica SP8 FALCON 使用技巧

2019-09-03 16:24:22 415
奥林巴斯显微镜


奥林巴斯显微镜

近期,我们介绍了 Leica SP8 FALCON 的一些应用案例,它能实时测量分子间的相互作用 (FLIM-FRET),实时测量钙浓度变化,实时测量荧光分子的代谢 (如癌变引起的 NADH 的寿命变化) 或者所处微环境的变化 (如 pH),能对光谱相近的不同染料或自发荧光和染料进行拆分,还能与共聚焦的多种采图模式 (如智能化大图拼接、光谱扫描、时间序列、三维层切) 和技术 (如 DIVE 多光子成像、STED 纳米分辨率成像) 相结合。总之, FALCON 是荧光功能成像的极佳工具。


那么今天咱们就讲讲 FALCON 的使用技巧,帮助大家更好地理解这个新技术。


荧光寿命测量步骤

SP8 FALCON 的荧光寿命成像 (FLIM) 功能内置在共聚焦操作软件 LAS X 里,只需点击 FLIM 即可激活 (见下图)。

奥林巴斯显微镜

接下来,我们只需三步就可以完成荧光寿命测量。本文中所用样品为雏菊 (Bellis Perennis) 花蕾。

1. 预览及调节参数


点击预览,系统同时显示荧光强度图、平均荧光寿命图和平均荧光寿命曲线,并以光子数直方图中的红线来提示光子数的理想上限 (见下图),便于我们调节激光强度获得理想的光子数 (以接近但不超过红线为宜)。

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2. 设置条件并采图


在采集时间、采集帧数及最大光子数三者中选择设置一项即可 (见下图),如果需要采集时间序列或者三维,按常规共聚焦采集模式设置总时长或层切起点/终点即可。然后点击 start 进行采图。

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3. 数据分析


选择寿命成分数量 (见下图一棕色箭头),点击 Fit (图一红色箭头),系统即自动进行曲线拟合。寿命成分数量可从 1 开始,直至获得满意的拟合曲线 (见图三)。同时,系统根据拟合结果显示荧光寿命图 (见图二)。

奥林巴斯显微镜

图一

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图二

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图三

到这里,图像和数据的采集及分析就完成了,点击保存图像和结果即可。


一键采图,一键拟合,so easy!


寿命成分拆分图像

当然,我们还可以根据拟合出的寿命成分对图像进行拆分,以上述分析结果为例,点击 FLIM Image Fit,系统自动按照拟合出的三种寿命进行拆分,得到以下图像。这特别适合于拆分光谱接近的不同染料或者染料和自发荧光。以后遇到多色荧光成像,再也不用担心串色和分不开了。

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对厚样品,FALCON 还可以直接采集和显示三维的荧光寿命图像 (见下图),要做成视频也完全没有问题,用 LAS X 的 3D 重建模块就可以。



SP8 FALCON 的功能还远不止于此,它还能进行任意感兴趣区域分析、FRET 分析、Pattern Match 分析,和 DIVE、STED 结合成像,以及近期刚刚增加的 Phasor 功能,为传统的荧光成像增加维度、拓宽思路。有兴趣的话,且听下回分解。

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