显微镜下的切割艺术：快速分离活细胞

上世纪 90 年代，美国国家癌症研究所（NCI）的 Lance Liotta 和同事在《Science》上发表文章，提出了一种称为激光显微切割（LMD）的技术。简单来说，LMD 就是在激光脉冲形成的能量差作用下，目标（组织、单细胞甚至亚细胞结构）边缘被切断分离，特异性地收集感兴趣区域，从而在下游实验（如二代测序、PCR 和蛋白质组学）中获得更加有效和准确的结果。

▲ Lance Liotta博士及其同事在《Science》上发表的文章

显微切割的材料可以是以各种方式贴附于固相支持物上的各种组织、细胞甚至生物大分子，其来源十分广泛，石蜡组织切片、冰冻组织切片、细胞爬片以及活细胞均可采用，之前对于组织切片的切割应用已有所描述，今天我们一起来看看徕卡 LMD 在活细胞提取上的应用实例。

在生物医学研究中，我们经常需要从混合群体中选择和分离具有相同特征的单个活细胞或活细胞亚群来获得细胞系或同种细胞群。常用的方法中，如荧光激活细胞分选法、磁活化细胞分选法、有限稀释法等技术只能够对非贴壁细胞进行选择性分离，上述方法都存在一个比较大的弊端——需要用到机械力或生物酶使细胞团分离，这对细胞的形态和活性会产生较大影响。与上述技术不同，徕卡LMD 使用紫外激光把目标切割下来，依靠重力作用自由掉落到收集装置内，有效避免了接触污染和外力损伤，保证了细胞的生物活性。

下面，让我们一起去看看 Podgorny 博士利用显微切割收集活细胞并再培养的整个流程。

将 HeLa 细胞悬液 2 ml（4 × 105 cells/ml）接种于显微切割专用的细胞培养皿内（直径 50 mm），这种培养皿的底部是聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）薄膜，可以先用多聚赖氨酸对培养皿内部的 PEN 膜进行处理来提高细胞的贴壁能力。为避免底部 PEN 膜污染，将专用培养皿放入直径 90 mm 的塑料培养皿中，培养一天，等到细胞贴壁后进行显微切割。

▲ 视频 1. LMD切割、提取多细胞

为了检查切割直径对细胞克隆形成率的影响，作者以 50~600 μm 的直径进行切割，获取的细胞再进行两天的培养，然后检查了克隆形成率。

▲ 图 1. 不同切割直径下的细胞克隆团 （标尺 100 μm）

经过培养后作者发现，切割直径在 100 μm 以上的细胞经过 2 天培养后，均可形成细胞克隆团（图 1）。

那么激光在切割的过程中对细胞会造成多大的损伤呢？带着这个疑问，作者进行了接下来的实验。

首先，在显微切割之前，给细胞标记了碘化丙啶（PI），PI 能够插入双链 DNA 中，它被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡的细胞的细胞膜。这样一来，在荧光模式下就能区别出哪些是功能正常的活细胞，哪些是死细胞。作者选取了全部是活细胞的区域。

▲ 图 2. 标记  PI 的  Hela 细胞（标尺 200 μm）

箭头所指的区域为荧光模式下显色的死细胞，作者将这些区域排除在外，进行了切割（图 2）。然后立即对收集到的样品进行了 SYBR Green 和 PI 双色标记，与切割之前的样品进行对比，从而判断激光对细胞的损伤程度有多大。

▲ 图 3. 标记  PI 和 SG 的  Hela 细胞（标尺 100 μm）

在荧光模式下可以观察到，紫外激光束只会对*边缘处的细胞造成损伤，对内部的细胞不会造成影响（图 3） ，根据作者的统计，细胞的存活率可以达到 83% 以上。

为了进一步观察经过激光切割后的细胞活力，作者以 200 μm 的直径获取了单个细胞，进行了长达 7 天的培养。

▲ 图 4. 单细胞克隆团形成过程（标尺 100 μm）

结果表明，在经过 7 天的培养，由单个细胞形成了单细胞克隆团 （图 4） ，这对于从混合群体中选择和分离具有相同特征的单个活细胞或活细胞亚群，以获得细胞系或同种细胞群具有十分重要的意义。

▲ 视频 2. LMD 快速提取单细胞

Leica LMD6 /LMD7 激光显微切割基于全自动研究级正置显微成像，借助重力收集样品，非接触式不会对切割样品造成污染。**的激光束运动模式可以在样品静止的同时实时快速、精确、可靠的切割。

此外，徕卡使用全套LMD专用物镜，对于UV光具有高透光率，20x， 40x和63x物镜均为长工作距离物镜，可以很好地兼容活细胞切割实验。