电子显微镜的结构、分类及应用
一、什么是电子显微镜
电子显微镜，简称电镜，英文名Electron Microscope（简称EM），经过五十多年的发展已成为现代科学技术中不可缺少的重要工具。电子显微镜技术的应用是建立在光学显微镜的基础之上的，光学显微镜的分辨率为0.2μm，透射电子显微镜的分辨率为0.2nm，也就是说透射电子显微镜在光学显微镜的基础上放大了1000倍。
二、电子显微镜的发展历史
(世界第一台电子显微镜)
1926年汉斯·布什研制了第一个磁力电子透镜。
1931年厄恩斯特·卢斯卡和马克斯·克诺尔研制了第一台透视电子显微镜。展示这台显微镜时使用的还不是透视的样本，而是一个金属格。1986年卢斯卡为此获得诺贝尔物理奖。
1934年锇酸被提议用来加强图像的对比度。
1937年第一台扫描透射电子显微镜推出。一开始研制电子显微镜*主要的目的是显示在光学显微镜中无法分辨的病原体如病毒等。
1938年他在西门子公司研制了第一台商业电子显微镜。
1949年可投射的金属薄片出现后材料学对电子显微镜的兴趣大增。
1960年代投射电子显微镜的加速电压越来越高来透视越来越厚的物质。这个时期电子显微镜达到了可以分辨原子的能力。
1980年代人们能够使用扫描电子显微镜观察湿样本。
1990年代中电脑越来越多地用来分析电子显微镜的图像，同时使用电脑也可以控制越来越复杂的透镜系统，同时电子显微镜的操作越来越简单。
三、电子显微镜的结构组成
电子显微镜由镜筒、真空装置和电源柜三部分组成。
镜筒主要有电子源、电子透镜、样品架、荧光屏和探测器等部件，这些部件通常是自上而下地装配成一个柱体。
电子透镜用来聚焦电子，是电子显微镜镜筒中*重要的部件。一般使用的是磁透镜，有时也有使用静电透镜的。它用一个对称于镜筒轴线的空间电场或磁场使电子轨迹向轴线弯曲形成聚焦，其作用与光学显微镜中的光学透镜（凸透镜）使光束聚焦的作用是一样的，所以称为电子透镜。光学透镜的焦点是固定的，而电子透镜的焦点可以被调节，因此电子显微镜不象光学显微镜那样有可以移动的透镜系统。现代电子显微镜大多采用电磁透镜，由很稳定的直流励磁电流通过带极靴的线圈产生的强磁场使电子聚焦。电子源是一个释放自由电子的阴极，栅极，一个环状加速电子的阳极构成的。阴极和阳极之间的电压差必须非常高，一般在数千伏到3百万伏特之间。它能发射并形成速度均匀的电子束，所以加速电压的稳定度要求不低于万分之一。
样品可以稳定地放在样品架上，此外往往还有可以用来改变样品（如移动、转动、加热、降温、拉长等）的装置。
探测器用来收集电子的信号或次级信号。
真空装置用以保障显微镜内的真空状态，这样电子在其路径上不会被吸收或偏向，由机械真空泵、扩散泵和真空阀门等构成，并通过抽气管道与镜筒相联接。
电源柜由高压发生器、励磁电流稳流器和各种调节控制单元组成。
四、电子显微镜的种类
电子显微镜按结构和用途可分为透射式电子显微镜、扫描式电子显微镜、反射式电子显微镜和发射式电子显微镜等。
透射式电子显微镜常用于观察那些用普通显微镜所不能分辨的细微物质结构；
扫描式电子显微镜主要用于观察固体表面的形貌，也能与X射线衍射仪或电子能谱仪相结合，构成电子微探针，用于物质成分分析；
发射式电子显微镜用于自发射电子表面的研究。
（一）透射式电子显微镜
透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）的组件包括：
1. 电子枪：发射电子，由阴极、栅极、阳极组成。
2. 聚光透镜：即电子透镜，将电子束聚集，可用于控制照明强度和孔径角。
3. 样品室：放置待观察的样品，并装有旋转台，用以改变试样的角度，还有装配加热、冷却等设备。
4. 物镜：为放大率很高的短距透镜，作用是放大电子像。物镜是决定透射电子显微镜分辨能力和成像质量的关键。
5. 中间镜：为可变倍的弱透镜，作用是对电子像进行二次放大。通过调节中间镜的电流，可选择物体的像或电子衍射图来进行放大。
6. 透射镜：为高倍的强透镜，用将二次放大后的中间像进一步放大后在荧光屏上成像。
7. 二级真空泵：对样品室抽真空。
8．照相装置：用以记录影像。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等都会影响到*后的成像质量，必须制备更薄的*薄切片，通常为 50～100 nm。
所以用透射电子显微镜观察时的样品需要处理得很薄。通常用薄切片法或冷冻蚀刻法制备：
（1）薄切片法
通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度 20～50 nm，采用重金属盐染色，以增大反差。
（2）冷冻蚀刻法 亦称冰冻断裂法
将标本置于-100°C 的干冰或-196°C 的液氮中冰冻后，以冷刀急速断开标本。断裂的标本升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻。蚀刻完成后，向断面以45o 角喷涂一层蒸气铂，再以90o 角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，剥下碳和铂的膜，称为复膜，能显示标本蚀刻面的形态。在电镜下观察得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。
（二）扫描式电子显微镜
扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）于20 世纪60 年代问世，目前分辨力可达6～10 nm。
其工作原理是由电子枪发射的精细聚焦电子束经两级聚光镜、偏转线圈和物镜射到样品上，扫描样品表面并激发出次级电子，次级电子的产生量与电子束入射角有关，即与样品的表面结构有关。次级电子经探测体收集后，由闪烁器转换为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。
扫描电镜的标本在检验前，需进行固定、脱水处理，再喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。
五、电子显微镜应用
电子显微镜技术在肿瘤诊断中的应用
透射电子显微镜突破了光学显微镜分辨率低的限制，成为了诊断疑难肿瘤的一种新的工具。有研究报道，无色素性肿瘤、嗜酸细胞瘤、肌原性肿瘤、软组织腺泡状肉瘤及神经内分泌肿瘤这些在光镜很难明确诊断的肿瘤，利用电镜可以明确诊断电镜主要是通过对*微结构的精细观察，寻找组织细胞的分化标记，确诊和鉴别相应的肿瘤类型。细胞凋亡与肿瘤有着密切的关系，电镜对细胞凋亡的研究起着重要的作用，因此利用电镜观察细胞的*微结构病理变化和细胞凋亡情况，将为肿瘤的诊断和治疗提供科学依据。
电子显微镜技术在肿瘤鉴别诊断中的应用
透射电子显微镜观察的是组织细胞、生物大分子、病毒、细菌等结构，能够观察到不同病的病理结构，也可以鉴别一些肿瘤疾病，有研究报道电子显微镜技术通过*微结构观察可以区分癌、黑色素瘤和肉瘤以及腺癌和间皮瘤；可区别胸腺瘤、胸腺类癌、恶性淋巴瘤和生殖细胞瘤；可区别神经母细胞瘤、胚胎性横纹肌瘤、Ewing氏肉瘤、恶性淋巴瘤和小细胞癌；可区别纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤和恶性神经鞘瘤以及区别梭形细胞癌和癌肉瘤。
六、电子显微镜的缺点
1.在电子显微镜中样本必须在真空中观察，因此无法观察活样本。随着技术的进步，环境扫描电镜将逐渐实现直接对活样本的观察；
2.在处理样本时可能会产生样本本来没有的结构，这加剧了此后分析图像的难度；
3.由于电子散射能力极强，容易发生二次衍射等；
4.由于为三维物体的二维平面投影像，有时像不唯一；
5.由于透射电子显微镜只能观察非常薄的样本，而有可能物质表面的结构与物质内部的结构不同；
6.*薄样品（100纳米以下），制样过程复杂、困难，制样有损伤；
7.电子束可能通过碰撞和加热破坏样本；
8.此外电子显微镜购买和维护的价格都比较高。
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