显微镜观察方式应用及原理

2018-08-17 16:54:08 admin 537

观察方式

1.明场观察——常规染色片(HE染色等)

2.暗场观察——微粒外观(细菌记数等)

3.相差观察——活细胞标本(细胞培养、膜片钳等)

4.偏光观察——双折射物质(晶体检测)

5. DIC观察——活细胞等(细胞培养,显微操作等)

6. RC观察  ——显微操作、活细胞观察

7.荧光观察 ——物质鉴定(抗体、抗原、荧光原位杂交等)

1)明场观察方式

应用领域:

常规镜检、病理、染色标本

优点:

视野亮度高、均匀,应用范围广,操作简单,价格低,物镜适用于荧光观察

缺点:

透明标本对比度低,标本没有立体感

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)暗视野观察方式

原理

丁道尔(Tyndall)现象,微粒对斜射光反射或衍射,增大了人眼可见性。

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2 特点

观察到极其微小物体,分辨率可达0.02 ~ 0.004 um (明场0.24um)—”超显微“。

3 缺点

只能观察到物体存在、运动和外部形态,不方便调节,标本要求高(灰尘、盖片、载片)

4 应用:
微小粒子、细菌形态观察、细菌记数,透明标本观察等

奥林巴斯显微镜

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暗场聚光镜(干镜)调节步骤
1)插上电源,打开主开关
2) 把样本放于载物台上                                   
3)上升聚光镜使上表面与载玻片尽量靠近              
4)将10X物镜转进光路                                  
5)下降聚光镜高度至视野变暗                          
6)科勒照明中心调节:(第一次观察前须完成此调节,完成后一般就不需要再调节)
7)对样品聚焦(会清晰看到载玻片上的灰尘,这就对了),调节瞳间距 ,调节屈光度              
8)若使用带虹彩光阑的物镜,可转动光阑调节环来改变数值孔径大小以达到最佳效果 

(三)相差观察方式

1 原理

利用被检物体的光程(折射率 x 厚度)差进行镜检,即利用干涉现象,将相位差变为人眼可以分辨的振幅差

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2 特点

鉴定活体细胞最实用、最经济的方法

3 缺点

需要光强高,切片不能太厚(2~10um),盖片、载片需符合标准,最好配用单色滤光镜,操作较麻烦,荧光效果不如明场物镜

4 应用:
无色透明活体标本的细微结构,检查,鉴定活体细胞(培养细胞,分离细胞)

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5 调节:

1、苛勒照明调节

2、将相差物镜及附件转入光路(物镜-聚光镜相衬环型号匹配)

3、对样品聚焦

4、取下目镜,装上CT望远镜,

5、调节CT焦距看到清晰的相差环

6、调节聚光镜上定位螺丝,使环状光阑象与相板共轭面重合

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(四)偏光观察方式

1 原理

依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以此判别物质结构的一种显微镜

各向同性:单折射体,光性质不因照射方向而改变,普通气体、液体、非结晶固体等

各向异性:双折射体,光速度、折射率、吸收和振动面、振幅随照射方向不同,晶体、纤维等

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应用(正交检偏):
矿物质、化学物品鉴别、鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体、植物病理检验、鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌、毛发、肝脏胶原和伤口愈合等

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调节(正交检偏)

1、调节柯勒照明

2、取出标本,将起偏镜和检偏镜移入光路

3、10x镜下旋转起偏镜至视野最暗

4、固定起偏镜

(五)微分干涉DIC)观察方法

奥林巴斯显微镜 奥林巴斯显微镜 1505887331355170.png

1 原理

通过特制的棱镜将偏振光分解为振动方向相互垂直,强度相等的光束,光束在极近的两点(小于显微镜的分辨率)上通过被检物体,从而在相位上略有差别,使图象呈现出立体三维感觉。

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2 特点

可以使被检物体产生三维立体感觉、分辨率高、观察效果更直观、无须特殊物镜,与荧光观察配合更好,可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。

奥林巴斯显微镜

奥林巴斯显微镜

3 缺点

需要光强高,双折射物质不能达到DIC镜检效果,不能应用于塑料容器培养物的观察,镜检灵敏度有方向性,调节较复杂,价格比较贵。

4 应用:
无色透明活体标本的细微结构,无色荧光标本,染色标本,显微操作等

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6 调节

1、10X 物镜调节柯勒照明

2、(可以参照偏光观察方法,先调节偏光镜正交)

3、拿走标本,取下目镜,观察物镜后焦平面

4、将起偏镜、物镜方DIC棱镜和检偏镜放入光路

5、旋转DIC调节旋钮,找到中间黑色干涉条文

6、旋转起偏镜角度,使黑色条文最黑

7、取下CT望远镜,重新安装好目镜

8、将聚光镜DIC棱镜放入光路

9、边调节物镜方DIC棱镜边观察,直到好的DIC效果

(六)浮雕相衬显微镜

1 原理

斜射光照射到标本产生折射、衍射,光线通过物镜光密度梯度调节器产生不同阴影,从而使透明标本表面产生明暗差异,增加观察对比度。

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2. 历史

1975年,Robert Hoffman 博士发明

2002年,专利到期,各显微镜厂家纷纷推出采用以自己名义命名的RC技术产品

3. 特点

提高未染色标本的可见性和对比度,图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕,可检测双折射物质(岩石切片、水晶、骨头) ,可检测玻璃,塑料等培养皿中的细胞,器官和组织,聚光镜的工作距离可以设计的更长,RC物镜也可用于明场,暗场和荧光观察。

4. 缺点

观察效果与标本方向密切相关,操作较复杂,必须有多元件,结构复杂的高数值孔径RC物镜,观察荧光效果不如明场物镜。

5. 应用

所有类型的细胞,组织(无论活体,染色,未染色),晶体表面细节,透明聚合物,玻璃和其它类似材料,尤其适用于显微操作 

6 调节

1、10X RC物镜调节柯勒照明

2、拿走标本,取下目镜,用聚焦望远镜观察调节器,将10X RC物镜对应的狭缝聚光镜内环板移进光路

3、调节狭缝的位置使无偏光镜的部分与调节器平面的灰色区域重合, 有偏光镜部分的像也要与调节器平面的透明区域重合。

4、旋转圆形起偏镜可以看到狭缝起偏镜从消失到出现的变化,狭缝最小取得图象的对比度最大。

5、重复上述方法调节每一种放大倍率的物镜。

6、取下CT望远镜,重新安装好目镜

7、放好标本用10X 物镜聚焦观察。

8、旋转标本和/或圆形起偏镜获得最理想的图像对比度.

9、对于不同标本来说可能都需要进行适当调节。

 

)荧光观察方法

什么是荧光 ?

    物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态,再回到低能状态时释放出的光,是非温度辐射光——冷光。即:物质吸收短波光,发射出的长波光。

显微镜荧光利用光源激发——光化荧光

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荧光的性质

吸收光,必需有激发光源、荧光波长>激发波长(损失热能)、荧光强度极小于激发光的强度、有不同程度的衰减、荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率。

荧光显微镜的优点和用途

检出能力高(放大作用)、对细胞的刺激小(可以活体染色)、能进行多重染色。

用途:

物体构造的观察——荧光素、荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等、发荧光量的测定对物质定性、定量分析。

有点:

检出能力高(放大作用)、对细胞的刺激小(可以活体染色)、能进行多重染色。

用途:

物体构造的观察——荧光素,荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等,发荧光量的测定对物质定性、定量分析

荧光显微镜的主要部件

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落射荧光显微镜的构造

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荧光显微镜光源

 汞灯光源:提供激发光(U、V、B、G)

 氙灯光源:高峰值更宽,更稳定

滤色镜的选择

荧光素

激发波长

发射波长

DAPI

372

456

AMCA

350

450

Hoechst 33258

365

465

FITC

490

520

Acridine Orange

490

590

Acridine Yellow

470

550

CY3

552

565

TRITC

541

572

Propidium Iodide

530

615

汞灯灯箱构造:灯室,上下、左右旋钮,聚光镜旋钮

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汞灯中心调节方法

1、放置荧光调中板或一张白纸于载物台上

2、转入B或G激发滤色镜

3、用10X物镜观察并聚焦

4、取下10X物镜

5、通过汞灯箱上聚焦旋钮聚焦汞灯电极于白纸

6、通过汞灯箱上下、左右旋钮调汞灯电极中心于白纸上圆环中心


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