奥林巴斯霍夫曼显微镜原理知识

2019-06-19 16:31:23 Pooher Inc. 142

霍夫曼调制对比系统旨在通过检测光学梯度(或斜率)并将它们转换为光强度的变化来增加未着色和生物材料的可见度和对比度。这项技术是由罗伯特霍夫曼博士于1975年发明的,并采用了多种适用于多种商业显微镜的配件。

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Hoffman调制对比度的基本显微镜配置如图1所示。被称为Hoffman 的“ 调制器 ” 的光学幅度空间滤波器被插入到消色差或平场色片物镜的后焦平面上(尽管也可以使用更高的校正) 。通过这个系统的光强度变化高于和低于平均值,根据定义,这个平均值据说是被调制的。用于调制对比度的目标可以覆盖10倍到100倍的整个放大倍率范围。该调制器有三个区域,如图2所示:靠近后焦平面周围的一个小的黑暗区域,它只透射1%的光线(图2中标记为“ D ”的区域);G “);以及其余的透明或透明区域,覆盖物镜后部的大部分区域,其透射100%的光(标记为” B “的区域“在图2中)与相位差显微镜中的相位板不同,霍夫曼调制器的设计不会改变通过任何区域的光的相位,当在调制对比度光学器件下观察时,在普通明场中基本上不可见的透明物体显微镜具有由相位梯度决定的明显的三维外观,调制器不会引起通过调制器不同部分的光的相位关系的变化,而是影响主要的零阶最大值,高阶衍射极大值不受影响。使用迈克尔逊干涉仪确认通过霍夫曼型调制器的光的相位变化(如果有的话)以小于λ/ 20的因子变化。

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在舞台下面,带有旋转转盘的聚光器被用来容纳霍夫曼调制对比系统的其余部件。该转塔式聚光器具有明场开口,带有用于常规明场显微镜的孔径光阑膜片以及为显微镜对准并建立科勒照明的适当条件。在每个其他转塔开口处,都有一个偏心的狭缝,部分被一个小矩形偏光片覆盖。狭缝/偏光镜组合的尺寸对于不同放大率的每个目标是不同的; 因此需要转塔布置。

Hoffman设计是这样的,即狭缝位于聚光器的前焦平面上,如图1和3所示。当光通过离轴狭缝时,它在物镜的后焦平面成像(也称为在傅立叶其中调制器已安装平面)。包含离轴狭缝板的聚光器的前焦平面与物镜后焦平面中的调制器光学共轭。图像强度与样本中光密度的一阶导数成正比,并受相位梯度衍射图的零阶控制。

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调制对比的原理提供了至少两个图2和图3所示的基本调制器 - 狭缝板配置。为了本讨论的目的,图2所示的调制器板的图示被放大并增加了尺寸。图2和图3(图2(a)和图3(a))左侧的布置是对称系统,其中调制器灰色条纹和狭缝都放置在显微镜的光轴(中心)上。此系统中的分辨率限于:

分辨率=λ/ NA

其中NA是物镜的数值孔径λ等于成像光源的波长平均值。黑色(1%透光率)和透光(100%透光率)区域的大小相同,而灰色(15%透光率)区域呈狭窄条纹形式,其为出瞳直径的10%的目标。另一种布置(图2(b)和3(b))是不对称或偏移的,其中调制器的暗区位于物镜的出射光瞳之外。这个系统的解决方案有了很大的改进和方法:

分辨率=λ/ 2(NA)

其中NAλ的值与上述相同。很显然,偏移系统中的分辨率(图3(b))几乎是中央系统(图3(a))的两倍。偏移系统中的透明(清晰)区域填充目标出瞳直径的近90%,灰色和黑色区域填充另外10%。

聚光镜下面,在显微镜的出光口上放置一个圆形偏光镜(注意两个偏光镜都在下面标本)。这个偏振器的旋转可以控制狭缝开口的有效宽度。例如,如图3所示,两个偏振器彼此成90度的“交叉”导致狭缝“变窄”,使得其图像落入调制器的灰色区域内。狭缝的部分由偏振器注册在调制器的亮区。随着偏光片旋转,对比度可以变化以达到最佳效果。狭窄的狭缝产生的图像非常高,与中等程度的连贯性相反。当狭缝调整到最窄位置时,光学部分成像也得到优化。当圆偏振片的振动方向与狭缝中偏振片的振动方向平行时,有效狭缝宽度最大。

调制对比系统的早期设计没有利用显微镜光端口上的狭缝偏振器或圆偏振器,并且依靠如图4所示的单一尺寸的狭缝进行对称配置。在该图中,来自光源的光通过固定光圈狭缝(在图中称为“狭缝板”),然后通过含有相位梯度的样本。根据梯度的方向,这些梯度将光线偏转到位于物镜后焦平面内的对称调制器的清晰或黑暗区域。得到的图像显示一个简单的对比度梯度,这取决于样品中相位梯度的位置和倾斜度。

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在现代先进的调制对比系统中,调制器和狭缝都偏离显微镜的光轴。这种安排允许更充分地使用物镜的数值孔径并产生良好的分辨率和细节。形状和细节呈现阴影伪三维外观。在灰色背景下,这些图案在一侧看起来较亮,中央部分灰色,另一侧较暗。调制器将光学相位梯度细节(陡度,斜率,折射率变化率或样本细节厚度)转换为目镜光阑平面图像各个区域强度的变化。所产生的图像具有明显的三维外观,并且对光学梯度具有定向灵敏度。

如图5所示,相反的梯度导致狭缝图像偏转到调制器的非常暗的部分或调制器的亮部分。在该图中,包含正和负相位(厚度)梯度的假想样本和使用调制对比度光学元件成像平坦(非梯度)区域。图5(a)中描绘的负梯度将光偏转到调制器的黑暗区域,在那里它衰减到其前值的大约百分之一。同样在图5(c)中,通过正梯度偏转到调制器的清晰区域的光未衰减,并且该光的100%被传输到中间图像平面中。样品的任何非梯度部分(图5(b))以及调制器灰色部分的背景(环绕)寄存器,其中约15%的光被传输到中间像平面。结果是梯度一侧的图像区域的强度很暗。来自梯度反面的强度产生明亮的图像区域,非梯度区域在图像上呈灰色,背景也是如此。

黑暗和明亮区域与灰色的对比(与强度的变化有关)会产生阴影的伪浮雕效果。这是调制对比成像的典型特征。旋转起偏器改变所获得的对比度,并且台上的样本(相对于起偏器和偏移狭缝)的取向可以显着改善或降低对比度。

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由于调制器根据样本的细节如何移动狭缝的图像(从而导致改变光强度)来影响狭缝的图像,所以它被描述为幅度滤波器。 霍夫曼和其他人已经证明样本中的相位梯度,如空间频率,分布在整个物镜的出射瞳孔上。调制器的光透射强度分布将提供令人满意的各种产生相位梯度的物体的图像,包括:所有类型的细胞和组织(活体,染色和未染色)以及晶体,透明聚合物,玻璃的表面细节和其他类似的材料。反射光调制对比显微镜也可用于成像不透明和冶金标本中的晶界,以及复杂集成电路和其他电子材料的表面细节。

有许多优点以及对调制对比度的限制。其中一些优点包括更充分地使用物镜的数值孔径,从而产生出色的细节分辨率以及良好的标本对比度和可视性。尽管许多标准调制对比度目标是消色差或平面消色差,但如上所述,也可以使用对光学像差具有较高校正度的目标。许多主要的显微镜制造商现在在萤石校正等级中提供调制对比度目标,并且可以通过特殊订单获得解调透镜。通常可以使用Modulation Optics,Inc.制造的调制器对旧的目标进行改进,该调制器由Robert Hoffman博士创建,专门用于构建售后和定制系统。

除了使用具有调制对比度的较高数值孔径的优点之外,还可以进行“ 光学切片”景深被定义为从不同细节的成像出现的一级到下一级的距离,并且由物镜的数值孔径来控制。较高的数值孔径物镜显示非常浅的景深,而对于较低数值孔径的物镜则相反。当样品的光学均匀性降低时,隔离并专注于特定光学部分的目标的整体能力会降低。

图像出现阴影或伪三维,由于细节两侧的对比差异而增强可见性。与使用相衬光学元件生成的图像不同,图像中不存在晕圈。调制对比度将相位梯度信息转换为与由相差显微镜产生的相位关系变化(和光学路径差异)非常不同的振幅差异。在调制器中使用黑色和灰色区域会生成包含不同灰度阴影的图像,并且不含颜色。通过产生调制器可以将颜色引入到调制对比图像中,其中灰色和黑色区域代替相同透射率值的彩色区域。在这种情况下,来自相位梯度的结果图像以具有相同色调的相似梯度的颜色呈现。目前,我们不知道任何含有彩色区域的调制滤波器的商业来源。

消色差或平面反射镜是调制对比显微镜最广泛使用的目标,因为它们可以产生良好的图像,因为不涉及颜色。将这些物镜与绿色滤光片(放置在偏光片下方)配合使用可以进一步改善图像,因为消色差物质在绿光下进行了球面校正。更高校正的目标,包括萤石和消色差片,也可用于调制对比显微镜,但增加的费用通常不值得提高图像质量,除非放大率非常高。

调制对比度附件的成本大大低于差分干涉对比(DIC)设备的成本。尽管这两种技术都需要转台冷凝器,并且每个物镜都配有匹配的组件,但配备DIC的显微镜还包含冷凝器下方的偏振器和位于光路(物镜上方)的中间图像平面之前的分析器。DIC显微镜所必需的交叉偏振系统的存在会降低其对偏振光反应的样品的有效性。

由于样本不在两个偏振器之间,所以可以检查可能混淆DIC中图像的双折射对象(岩石薄片,水晶,骨等)。此外,由于极化效应,样品可以容纳在塑料或玻璃容器中而不会使图像劣化,因为这些容器也在两个偏振器之上,而不是在它们之间。这使得霍夫曼系统在塑料容器中进行的细胞,组织和器官培养的检查和显微摄影中比DIC更有用。

当冷凝器设置在明场位置时,安装调制器的物镜也可用于常规明场工作。由于调制器是离轴的,因此图像的恶化很少。配备调制器的物镜(但不是狭缝板聚光镜)也可用于荧光和暗场工作,但在尝试DIC显微镜时应避免这些目标。调制对比系统已经非常成功地用于偏振光显微镜以增强样品中光学梯度和双折射的检测。在这个应用中,使用非偏振狭缝,偏振光配置应该是平行偏振器(尽管正交偏振器也会产生良好的结果,尽管照明减弱)。

霍夫曼调制对比系统也有几个缺点和限制。必须谨慎看待图像,因为不同的观察者可以通过目镜观察伪三维图像,从而可以将图像中的“山”看作是“山谷”,反之亦然。该系统对垂直于狭缝长度的梯度最为敏感,导致需要一定程度的样本取向技巧以获得最佳效果。

每个物镜和冷凝器开口的改造成本必须添加到这些附件本身的基本成本中。复杂的高数值孔径,多元件物镜难以修改或太昂贵。近年来,罗伯特霍夫曼的公司Modulation Optics纽约Greenvale(Slant Fin Corporation的全资子公司)一直在生产改良的物镜和冷凝器。调制光学器件专门修改由领先的显微镜制造商生产的物镜。一些目标很容易修改,而有些目标很难或不可能根据调制光学规范进行修改。但是,任何目标都可以与公司的中间管系统一起使用,包括覆盖微距照相机镜头到100倍显微镜物镜的广泛范围。该类别还包括设计用于对干燥或浸没介质(油,水和甘油),单波长和多波长物镜,反射和透射光物镜以及经过无限长度或有限长度管校正的物镜成像的物镜。

非吸收性样品不会呈现彩色,除了那些使用含半透明彩色滤光片的特殊调制器代替灰色和黑色区域观察到的样品外。自然吸收特定波长或轻度染色的样本会呈现颜色以及调制对比度和荧光组合或者调制对比度和偏振光组合所观察到的样本。

霍夫曼调制对比度显微镜的配置非常简单,基本步骤如下:

透射光中的霍夫曼调制对比度

  • 将相关的调制对比度物镜连接到显微镜的鼻镜上,并安装包含适当狭缝板的转塔冷凝器。如果显微镜配备了差分干涉对比(DIC)或偏光显微镜,请从光路中取出所有偏光器,延迟板以及Wollaston或Nomarski棱镜。

  • 放置一个染色的标本(最好是组织薄片)在舞台上,并使用10倍物镜(调制器安装),对准显微镜适当科勒照明,在我们的显微镜解剖学部分概述。此操作应将调制对比狭缝板从冷凝器中取出。如果转塔聚光器有一个用孔径光阑进行明场照明的位置,则转动转盘选择该聚光器。

  • 使用Bertrand透镜(在偏光显微镜上常用),相位望远镜或通过简单地移除目镜并向下窥视眼管,在物镜的后焦平面中查看调制器板。确保将样品从光路上取下或将其移至显微镜载玻片上的清晰区域。

  • 通过将适当的聚光器(从转台)移动到光路中来选择对应于10倍物镜的狭缝光圈板。应该有一套调节螺丝或一个杠杆,使得冷凝器内的照明狭缝板能够旋转和平移。

  • 将圆形偏振滤光片放在冷凝器下方的显微镜光端口上。旋转此滤镜时,通过Bertrand透镜(或相位望远镜)观察狭缝图像,并观察旋转角度会影响通过狭缝偏振器部分的光量(亮度)。

  • 如图3(b)所示,平移狭缝的图像,使得缺少偏振器的开放部分叠加在调制器板的灰色区域上。含有偏振材料的狭缝部分应该在调制器的透明部分正好在灰色区域的右侧成像。旋转圆偏振滤光片,观察包含偏振材料的狭缝区域是如何出现和消失的。当圆偏振器的振动平面垂直于狭缝中偏振器的振动平面取向时,如果获得最小化和最大对比度,则获得狭缝尺寸。这种操作可以使用下面的交互式Java教程来实践:

  • 取下Bertrand镜头或相位望远镜,并更换显微镜眼管中的目镜。在舞台上放置一个标本候选人,并将焦点放在10倍物镜上。

  • 通过重新聚焦视场光阑来实现清晰的焦点,重新调节聚光镜的位置。打开区域光圈,直到它位于视场外。

  • 图像现在已准备好用于观察或调制对比的显微摄影。在显微镜底部旋转标本和/或圆形偏光镜,以获得最佳对比度。这些设置因样本而异。

  • 每次选择不同的放大倍数以在调制对比度中观察样本时,重复上述步骤。

我们再一次发现,在聚光镜的前焦平面上(通过偏移狭缝)对光进行处理以及在物镜(偏移调制器)的后焦平面上对光的处理可以对所呈现的图像产生显着影响在目镜中。


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查看原始的英语文章:Hoffman Modulation Contrast Basics




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