奥林巴斯微分干涉显微镜和相差显微镜的区别

2019-06-19 16:31:23 Pooher Inc. 668

相差和微分干涉对比(DIC显微镜是互补技术,能够产生透明生物相的高对比度图像,这些图像通常不会影响穿过样品的可见光波的振幅。由于相位差是人眼无法察觉的,并且在明场照明下不容易观察到,因此必须适当修改通过显微镜的光路以产生令人满意的相样品图像。许多流行的对比增强技术都依赖于相样本的能力来改变横穿生物材料的波与穿过周围介质的波之间的光程差。

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也许微分干涉对比度和相差显微镜之间最根本的区别在于互补技术形成图像的光学基础。相位对比产生的图像强度值作为样本光程长度大小的函数,非常密集的区域(具有大的路径长度的区域)比背景更暗。或者,当叠加在中等灰度背景上时,具有相对较低厚度或低于周围介质的折射率的样本特征变得更轻。

微分干涉对比的情况非常明显,其中光路长度梯度(实际上是波前剪切方向的变化率)主要是将对比度引入样本图像的原因。路径长度的陡峭梯度会产生出色的对比度,并且图像会显示DIC技术特有的伪三维浮雕阴影。具有非常浅的光路斜率的区域(例如在延伸的平坦样品中观察到的区域)产生不显着的对比度,并且经常以与背景相同的强度级出现在图像中。

除了造影机制的差异之外,DIC和相衬图像在许多其他特征方面有所不同。图1所示为几种数字图像,比较DIC中捕获的样本和相差。图1(a)显示了人颊黏膜上皮(颊)细胞,显示上表面的细胞核,细胞质内含物和许多细菌,并用微分干涉对比成像。图1(b)说明了具有相位差照明的相同视场。相衬图像在细胞周边和细胞核周围具有明显的晕圈,这在微分干涉对比度图像中不存在。光学切片DIC显微镜检查(未示出)揭示细菌存在(几乎完全)存在于浸泡在周围介质中的膜表面上,而不是躺在细胞下侧。这一事实不能通过相位对比来明确确定。

在图1(c)中,用差分干涉对比成像的厚的鼠肾组织部分揭示了封闭在小管内的一束细胞。相同区域的相位对比图像(图1(d))混乱并受到聚焦平面外相位晕的干扰。然而,几个细胞核在相衬图像中看起来是可见的,这在DIC中是不可区分的。Obelia的放大倍率相对较高图1(e)和1(f)分别示出了DIC中的息肉状茎状茎周围和相衬。在DIC中(图1(e)),环形结构呈半球形,内部射线从杆径向发出。此外,在茎结构内可见粒状颗粒,但解剖细节大部分未定义。相位差图像(图1(f))被环形环周围和杆内的光晕混淆。

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微分干涉对比相位对比的主要优点是能够在完全数值孔径下使用仪器,而没有相位板或聚光器环的遮蔽效应,这严重限制了聚光器和物镜孔的尺寸。主要优点是提高了轴向分辨率,尤其是DIC显微镜在大光圈尺寸下能够产生出色的高分辨率图像。图2所示为采用微分干涉对比(图2(a))和相衬(图2(b))显微镜的物镜后孔径的Bertrand透镜采集的数字图像。在这两种情况下,目标是具有0.75的数值孔径的40x萤石,并且聚光器孔径光阑打开到最大直径尺寸。

定向效果

相差不存在微分干涉对比中固有的显着方位角效应,其表现为分束Nomarski(或改进的Wollaston)棱镜相对于显微镜光轴和偏振器的不对称取向。由于相差显微镜聚光镜(图2(b))中的环形相位板在360度旋转对称并从各个角度均匀照射样品,因此不会出现取向效应。结果,相位对比度图像与方向无关,并且不受旋转依赖性对比效应的影响。对于以微分干涉对比度成像的许多样品,为了获得最大对比度(平行于或垂直于剪切轴)的先决条件取向限制了样品旋转的自由度,

微分干涉对比度中的方位对比效应可以通过为显微镜配备360度旋转圆形样品台而获益。最初设计用于偏振光显微镜观察,圆形平台使操作员能够相对于棱镜剪切轴旋转样本,以便最大化或最小化所选样本特征的对比度效果。在DIC显微镜中的对比度达到了沿剪切方向延伸的线性相样品的最小水平,但是可以通过将该台旋转几度显着变化。非线性标本,如细胞,组织切片,颗粒和无定形聚合物,在DIC中不显示明显的方位角效应,并且通常可以令人满意地以各种方向成像。

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图3中显示了两个线性标本,其具有在相衬和DIC中成像的显着量的周期性和不对称性。在这两种情况下,从DIC获得的图像中的对比度很大程度上取决于样本相对于显微镜剪切轴的方向,而相位对比度图像特征与围绕显微镜光轴的样本旋转无关。图3(a)和3(b)中的图像是在DIC中从安装的双侧对称伸长的羽状硅藻体的样品中获得的。当硅藻的长轴与Nomarski棱镜剪切轴平行排列时(图3(a)),可以容易地观察到硅藻的脊和孔。图3(a)右上角的白色箭头表示图3所示的DIC图像的Nomarski棱镜剪切轴。将硅藻旋转90度(垂直于剪切轴)减少了平截球体图像的对比度并且遮蔽了显微结构中存在的重要细节。例如,在图3(b)中,在图3(a)中在硅藻壳的边缘和中心处容易观察到的纵向脊不存在。当使用相差光学系统(图3(c))成像时,同一标本中不存在方位角效应,不管样本的方向如何,它都显示出相似的对比度。请注意,图3(c)中的图像对比度更类似于图3(b)中DIC图像所显示的对比度,而非图3(a)中呈现的高对比度图像。在这种情况下,

DIC中存在的方位效应的第二个例子,但缺乏相位差,如图3(d)至3(f)所示。该标本是一个半透明的ctenoid鱼鳞,其含有严重缺乏对比度的菱形包裹体,并且在叠加在鳞片的条纹体刺上时很难区分。当DIC显微镜(图3(d))中,当躯干棘突定向为平行于剪切轴的体刺时,透明矩形内含物变得可见并且掩盖身体棘。旋转显微镜载物台90度降低了夹杂物的对比度,并且条纹刺变得清晰可见(图3(e))。在相衬(图3(f))中,夹杂物伴随着晕圈以及条纹刺,

微分干涉对比中的图像对比度和样本定向之间的相关性通常可用于扩展线形样本的研究。例如,硅藻壳和类似标本中的高度有序结构可能重叠,导致在相差和类似对比度增强技术中观察到的图像混淆。通过在多个方位捕捉图像,DIC显微镜往往能够更清楚地了解许多延伸的线形标本中存在的复杂形态。另外,当光学切片方法与方位特定成像耦合时,差分干涉对比显微镜常常可以揭示使用替代技术难以或不可能区分的特征。

光晕和阴影伪影

卤素阴离困扰相差光学系统的伪影在微分干涉对比度图像中很大程度上不存在。在正相位对比中,具有比周围介质更高折射率的标本特征被明亮的边缘(光晕)环绕,这往往掩盖了边缘细节。尽管通过对目标相位板设计进行构型修改,可以将晕圈抑制到一定程度,但它们不能完全消除。在一些情况下,差分干涉对比度图像沿着具有非常陡峭的光学梯度的边缘受到过度亮度的影响,但是这种效果通常在偏差延迟值太低时发生,并且可以通过适当调整Nomarski棱镜(或deSénarmont补偿偏振器)的位置。

相位差的光晕的存在和严重程度部分取决于样品和周围介质之间的折射率差异。通常,相差标本包含各种各样的结构,这些结构显示出大幅波动的折射率,这些结构一起产生复杂的图像。具有比周围介质更低的折射率的区域表现出暗光晕,而不是围绕更高折射率特征可以观察到的明亮光晕。由于相差显微镜光学系统的配置参数而出现晕圈。由于衍射波前的球形性质,样品偏离的一小部分入射光通过物镜相位板。较小的标本特征引起较大的衍射角度,

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图4显示了相对于DIC图像相对于光晕伪影的比较,其中三个通常成像的透明样品。当在中等和高放大倍数下以正相位对比成像时,人类红细胞(红血细胞)在盘形细胞周围呈现独特的晕圈(图4(a))。请注意,由于该区域的光路长度减少,红血球盘的中心部分比外围更轻。当在差分干涉对比中检查相同的视场时(图4(b)),细胞周围的晕圈伪影不存在,但是图像获得沿Nomarski棱镜剪切轴(从西北到东南)取向的阴影投影外观,

经常观察到在单层培养中生长的活细胞,并使用相差和微分干涉对比显微镜进行成像。在玻璃盖玻片上培养的几个贴壁HeLa细胞在图4(c)中用相差光学器件说明。光晕伪影环绕着细胞膜的外围,并且在细胞内的一些较大的细胞器上也是明显的。虽然许多细胞内部细节以高分辨率出现在图像中,但细胞内合约的信息被相邻细胞膜之间出现的亮(晕)区抑制。当用微分干涉对比度成像时,在相同视场(图4(d))中没有晕圈伪影是明显的。细胞的内部细节在DIC中不太明显,但细胞膜的周边比相衬更清楚地成像。事实上,DIC图像中相邻细胞的紧密邻近非常明显,这使得该技术更精确地研究细胞间事件,如接触抑制。

丝状绿藻类Zygnema的成员呈现出由重复的单个细胞单位组成的拉长的线性结构。在相衬(图4(e))中,丝状Zygnema样品在棒状藻类细丝外部显示出明显的晕圈,但也包含晕圈伪影遮掩的大量内部细节。双对称U形重复的内部细胞结构(图4(e))产生大的晕圈,其显着降低对比度并掩盖较小的特征。微分干涉对比消除了Zygnema的相位对比图像中出现的光晕伪影(图4(f)),并且显示出在细丝中心存在的更多内部细节。然而,为了获得有关Zygnema丝状结构的最确切的结论,两种成像技术应该联合使用(如上述许多样品的情况)。

如上所述,具有比周围介质更高的折射率的样本特征在周边周围显示明亮的晕圈,并且当用正相位对比度光学系统成像时呈现更暗的中心部分。当观察到具有比介质更低的折射率的特征时(暗光晕和光内部区域),会出现相反的效果。光晕效应随样品特征的大小而变化,并且严重依赖于样品与周围介质之间的折射率差异。折射率差异越大,会产生更明显的光晕效应,这也取决于仪器参数,如相位板尺寸和中性密度以及客观放大倍数。此外,

DIC显微镜的情况完全不同,其中大的折射率差异和样品特征尺寸不影响图像质量。实际上,样品与其周围介质之间的明显折射率差异通常是非常需要的,并且通常在差分干涉对比中导致出色的图像。特征尺寸通常在DIC显微镜中不存在问题。通常可以与微分干涉对比度光学系统同时(并排)对尺寸和折射率波动较大的样本进行成像,以产生具有优异对比度的结构,这使得甚至可以观察和识别微小的细节。

相比DIC显微镜,光晕伪影和图像对比度也受到样品光学厚度的影响,其相差大得多。在较大的光程差(高达半个波长)时,可能会产生模糊的相衬图像,因为样本中最厚的特征常常显示与最薄特征非常接近或相同的对比度级别。这是由光路长度(试样厚度和折射率),对比度和相角之间的复杂关系引起的。一般而言,理想的相差标本在光程差中不应具有超过十分之一波长的特征。DIC显微镜也需要薄样本,但该技术能够生成合适的图像,样品的厚度值(和光程长度)要比相差较大。然而,非常厚的样本会对客观和聚光棱镜之间的干涉平面重叠产生负面影响,从而降低DIC图像的质量和对比度。

在均匀光路长度的扁平,延伸样本中,通常在相差显微镜中观察到称为遮光的伪影阴影表现为样本的中心部分显示对比度逐渐降低,直到强度接近周围媒介的强度。在极端情况下,由于其晕圈的存在,扩展标本只能在相位对比下看到。在DIC中,图像强度的变化仅在光程差显着变化时才会发生,并且扩展标本的边界通常是这种技术可以识别的唯一特征。

景深和光学切片

因为相位对比图像在样本光路长度在大范围内波动时可能变得模糊(甚至经历对比度的逆转),所以该技术应该限于具有十分之一波长或更小的路径差的样本,如前所述。换句话说,厚的标本或具有楔形结构的标本通常不适合用相差显微镜进行定量研究。薄的标本也倾向于在差分干涉对比中产生出色的图像,但是使用光学切片技术也可以在较宽的孔径处拍摄较厚的标本(具有十分之一波长和全波长之间的光程差)。

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相位对比度中的照明孔径由冷凝器环形的大小固定,并且不能改变以实现增加或减小的景深。这种限制妨碍了观察含有明显晕环伪影的样本,这些样本有时会遮蔽聚焦样本的特征,这是由于起源于源自目标焦平面外的过量光的重叠细节造成的。当试图对相差太大的样品进行成像时,经常出现这样的问题。然而,如前所述,微分干涉对比显微镜(在宽聚光器孔径处)的光学切片能力使得能够用相对厚的样本获得优异的图像。

差分干涉对比中厚试样的大孔径光学部分的优点如图5所示,并与相位对比成像的相同视场相比较。图5(b)示出了来自Obelia水獭的生殖息肉的美杜莎芽,其在DIC中以高放大倍数成像,其中聚光镜虹膜光圈开口设定为物镜孔径大小的大约95%。由此产生的薄的光学部分显示了美杜莎特征的清晰聚焦的图像细节,这些细节仅被源自焦平面的光线最小化地遮蔽。当相位对比检查相同的视场时(图5(a)),由于光学系统的光圈受限制,美杜莎图像被晕圈模糊并且展现出降低的分辨率。

图5(c)至5(f)中提供了类似的情况。图5(c)描绘了来自北美最常见的蝴蝶之一的帝王蝶(Danaus plexippus)的重叠翼鳞在图5(c)中,单个尺度在图元(c)中是无法区分的,因为光晕伪影和不在焦点平面上的模糊特征。一般来说,图像被大量的伪影混淆,使得标本特征难以辨认。在微分干涉对比(图5(d))中对相同样本进行成像可以消除许多远离焦平面的干扰伪影,并且清晰地描绘单个翼标中的表面特征。同样,在一个犬绦虫腹部的鸡蛋包(Dipylidium caninum)显示在DIC中成像时围绕单个蛋的锐边(图5(f))。然而,集中的鸡蛋在相位对比中缺乏独特的结构(图5(e)),主要是由于其他鸡蛋发出的晕圈远离焦平面。

在大的聚光器孔径尺寸和高数值孔径下微分干涉对比度的光学切片能力对于在厚相样品中成像单焦平面是至关重要的。来自位于直接焦平面之外的特征的细节和杂散光不会以与相位对比图像相同的方式妥协DIC图像,相位对比图像通常被晕圈伪影复杂化。结果,即使当大的景深由于重叠的细节而导致在相差显微术中不可能识别相位结构时,也可以采用微分干涉对比度以在有些不利的条件下(非常厚的样品)获得优异的图像。

双折射标本

与DIC相比的优点是能够成功地对二向色和双折射标本进行成像。由于微分干涉对比度光学系统依赖于偏振光来建立波前场的取向,因此双折射或二向色样品对普通和非常规波的差别吸收导致混淆的图像。相差不需要使用偏振光,并且没有双折射标本产生的光学干扰。

微分干涉对比显微镜中涉及双折射伪影的主要问题之一是塑性组织培养容器的广泛使用。模制聚合物容器结构固有的应力会产生过度的双折射,使光线去偏振并混淆DIC图像的解释。因此,在这些容器中生长的活细胞不能用微分干涉对比令人满意地成像,而是通常用相差或霍夫曼调制对比度光学系统观察和拍摄。

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典型的由DIC成像双折射标本产生的伪影如图6所示,以及相位对比度相同的视场图像。淀粉储存颗粒(出现小球)从四重马铃薯薄片(马铃薯(Solanum tuberosum))组织,也说明了具有周皮,皮质和减少的维管组织的成熟块茎的一部分,如图6(a)和6(b)所示。由于马铃薯淀粉颗粒中的碳水化合物显示出有序的层状分子结构,因此部分颗粒(以及在某些情况下为整个颗粒本身)具有双折射性并吸收离开冷凝器Nomarski棱镜并穿过样品的偏振波前。结果,在DIC显微镜下观察到的马铃薯淀粉颗粒显示干涉色和具有球形对称性的双折射各向异性试样的典型马耳他十字型(源自交叉偏光片)(图6(b))。DIC中的双折射假象掩盖了淀粉颗粒的大部分内部结构,

图6(c)所示的是单根人造丝纤维的相衬图像,显示了存在于聚合物表面和内部的凹痕形态。人造丝由纤维素,棉短绒或木屑通过用氢氧化钠和二硫化碳处理散装材料,然后将得到的粘稠溶液通过喷丝头制成。在这个过程中生产的纤维具有长程有序性,并且通常具有非常高的双折射性。人造丝纤维的DIC检查(图6(d))证实了双折射特性,该特性表现在图像中存在的牛顿干涉色中。这些颜色虽然美观,但会模糊标本的细节,并降低DIC用于此类成像材料的实用性。图6(b)和6(d)中所示的双折射图像使用相对较薄(5-20微米)的低放大率(20x)样本进行记录,这些样本在整个视场中保持清晰的焦点。当使用DIC对较厚的双折射标本进行成像时,源自远离焦点的平面的干涉颜色倾向于将样本细节模糊得更大。因此,随着样品厚度的增加(对于双折射样品),在DIC中产生的结果图像倾向于失去对比度并且质量迅速恶化。源自远离焦点的平面的干涉颜色倾向于将样本细节模糊得更大。因此,随着样品厚度的增加(对于双折射样品),在DIC中产生的结果图像倾向于失去对比度并且质量迅速恶化。源自远离焦点的平面的干涉颜色倾向于将样本细节模糊得更大。因此,随着样品厚度的增加(对于双折射样品),在DIC中产生的结果图像倾向于失去对比度并且质量迅速恶化。

通过比较图6(e)和6(f),使用微分干涉对比显微术观察与塑料组织培养容器中生长的细胞相关的问题是显而易见的。几个印度Muntjac(麂属muntjak)单层培养中的鹿皮肤成纤维细胞在图6(e)中示出,其使用倒置组织培养显微镜上的相位对比的长工作距离物镜和冷凝器组合成像。将细胞在具有约1.2毫米的上下壁厚度(聚苯乙烯的组合厚度为2.4毫米)的模制聚苯乙烯容器中生长。即使相位对比物具有设计用于通过厚玻璃或塑料进行观察的校正环,与在薄(170微米)盖玻片上成像的细胞相比,图像质量受损(比较图6(e)至图4(c) )。然而,大部分细胞内部细节仍然可见,包括细胞核,核仁,空泡和许多较小的颗粒。

在微分干涉对比中,由于双折射聚苯乙烯容器的吸收和干涉效应,图6(e)中所示的培养的印度Muntjac成纤维细胞失去了显着量的对比(图6(f))。因为容器壁相对较厚,所以应变双折射在组织培养容器的上壁中的普通和异常波前在穿过细胞之前去极化,并且在离开细胞并穿过下壁之后再次去极化。结果是对比度下降非常严重,只有当冷凝器隔膜几乎完全闭合时才可以成像细胞(类似于使用透明标本的明场技术)。在这些条件下,除了低对比度之外,图像还显示许多衍射伪影,

如上所述,利用微分干涉对比显微术检查双折射标本中的主要误差来源于使用偏振光的必要性。在双折射标本中,偏振正交(普通和非常规)波前被吸收到不同程度,这取决于它们相对于标本内各向异性分子的取向。因此,当正交波前在目标Nomarski棱镜中重新组合并通过分析仪时,它们会干扰不同的强度。因此,最终图像不仅是两个波前(通常是DIC中的关键因素)所经历的光程差的函数,而且还是由样本引起的两个光束的差分振幅。对图像的影响类似于显微镜配置,其中偏振器和分析仪的透射轴不完全垂直(实际上,略微未交叉)。由于相位差不依赖于偏振光,因此该技术大部分没有由双折射标本引起的伪影。

染色标本

在相差显微镜下,由于吸收可见波长的目标相位板,轻微染色的幅度样本(不一定是双折射的但可能保留相当大的相位梯度特征)经历减弱的强度。然而,当存在大量的光程梯度并且两个极化波阵面被同等吸收时,这些样本经常可以在微分干涉对比中产生令人满意的结果。事实上,细胞内细胞器(例如,完整的细胞核和中期染色体)的选择性染色可以与DIC显微镜成像耦合,以便增强细胞固定时发生的标本细节和分离事件。

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图7中示出了用常见生物(可见光吸收)发色团染色并用相差和DIC显微镜成像的样品的几个实例。图7(a)给出了在微分干涉对比中观察到的人体脂肪染色脂肪组织的薄切片,图7(b)给出了相位对比相同的视场。相衬图像令人困惑,并且缺乏精细细节的分辨率,主要是因为光晕伪影掩盖了生物染色的优点。相位对比显然不适合从该样本中检索任何重要信息。另一方面,相同样本的相应DIC图像(图7(a))使阴影投影伪三维浮雕中的脂肪球呈现,这使得它们与图像中的其他特征相区别。

使用图7(c)中的DIC显微镜观察到相同的效果,其中在高对比度下可观察到青蛙睾丸薄切片内差异染色的减数分裂核和染色体。该图像受益于巧妙应用多种染色剂,这有助于将遗传物质与其他细胞内成分进行色谱分离。实际上,当在DIC中成像时,样品产生比在明视场照明的目标观察模式中更明显的信息。相位对比中的相同视场(图7(d))被密集染色的细胞内成分周围的晕圈混淆,在这种成像模式下这更难以区分。对于图7(e)和7(f)中呈现的哺乳动物牙齿薄切片存在类似情况。在DIC中,(图7(e)),而不是最佳的光程差耦合到过度掩盖这些结构的相位对比(图7(f))。图7中的例子提供了强有力的证据,即使相同样品难以在相衬中成像,微分干涉对比也是观察轻染样品的合适技术。

结论

DIC和相差显微镜之间最明显的区别是由微分干涉对比光学系统形成的伪三维阴影投影图像。标本图像呈现的方式让人联想到多年来在电子显微镜中使用的阴影技术,这些技术可提供有关标本地形特性的信息。然而,在DIC中,图像中明显的山丘和山谷绝不能被误认为标本中实际地形剖面的标志,因此应始终谨慎解读。相位对比不会产生具有明显三维特征的图像。

表1总结了相差和微分干涉差异显微镜之间的许多相似性和差异,包括图像亮度,分辨率,相移限制,伪影,样品特性和成本等。总之,相位对比度和DIC的图像亮度都比普通的明视场观察少得多(只有百分之几),但是这些对比度增强技术能够提供更高度定义的图像。对于DIC显微镜来说,照明比相衬更重要,特别是在高倍率下使用低透射率偏振片时。为了令人满意的成像,通常需要100瓦的卤钨灯或水银弧放电灯,而相差显微镜则可以充分发挥50瓦白炽灯的功效。横向(xy)和轴向(z)的分辨率显着地超过了相位对比度,即使在两种情况下相移检测极限相似,但在两个维度中都表现出适度或较差的分辨率。

相位对比度和DIC显微镜的特性
特性相位对比DIC
图像亮度
(明视野= 100%)
1.3%0.36 - 2.3%
Epi-Fluorescence Light Loss 
(明场= 0%)
28%73%
横向解决方案冷凝器
环空
限制
优越
轴向分辨率
(深度辨别)
较差的优越
照明孔径
目标NA10%
变量
相移
检测限制
<λ/ 100<λ/ 100
高相位转换的效用没有用有用
方位效应没有
晕和阴影没有
染色标本没有用有用
双折射标本有用没有用
双折射标本
容器
没有
明场图像
恶化
轻微没有
成本中等
表格1

使用光学切片技术可以在微分干涉对比度下容易地成像具有大光程差的厚相位样本,但是由于光晕伪影常常难以用相位对比成像。其他因素,例如方位效应和在DIC中对染色标本进行成像的能力,有助于抵消这两种技术。相位对比对组织培养实验室的常规观察来说非常有用,其中塑料培养皿中的活细胞成像是日常活动。或者,高分辨率信息最好使用微分干涉对比方法(通常耦合到时间推移视频)进行活细胞成像。一般来说,DIC需要更多的技术技能来配置和操作,包括复杂的对齐过程,样品焦点的连续操作,孔径光阑光阑调整,样本定位和目标Nomarski棱镜的横向位移以实现最佳对比度。相差显微镜比较容易对准和操作,并且可以由相对缺乏经验的显微镜专家相当有效地利用。

相差在通用性方面限于使对比度差的透明相样品成像。相反,DIC显微镜可用于染色和未染色的标本,但遇到双折射特征时出现伪影。通过平移DIC中的目标棱镜(或deSénarmont补偿器)可以更好地控制样本对比度,DIC可以在很宽的位置范围内调整目标棱镜(或deSénarmont补偿器),以实现不同程度的灰度干涉颜色,或在较大路径上实现多色光学染色效果差异。此外,还可以在DIC中调节聚光器孔径光阑,以改变样品的对比度和分辨率。相衬仅限于冷凝器环形隔膜和物镜中的物镜相位板所提供的对比度。

在许多实验室最重要的考虑因素中,比较DIC和相位差时,是附件组件的成本。由于DIC需要几个昂贵的双折射Nomarski棱镜和无应变光学元件(物镜和聚光镜),因此仪器比相差元件昂贵得多。在许多情况下,特别是当显微摄影和/或数字成像不是主要考虑因素时,相衬通常会用于实验室的目的。然而,当必须从活细胞和组织或类似的脆弱透明相样品获得高分辨率图像时,差异干涉对比是选择的技术。

一般来说,相衬和微分干涉对比显微镜应该被认为是互补(而不是竞争)技术,并且一起用来充分研究样品的光学性质,动力学和形态。具有较低中性密度的相位板的现代相衬物镜的引入使得显微镜专家能够在许多情况下针对明场,荧光,相衬和DIC成像利用单组物镜。



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标签: 微分干涉

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