奥林巴斯微分干涉显微镜/DIC显微镜基础知识

2019-06-19 16:31:23 Pooher Inc. 225

使用显微镜物镜和聚光系统的全光圈和分辨率,在传统明场照明下通常难以观察到活细胞和其他透明未染色标本。相位对比最早由Frits Zernike在20世纪30年代开发,通常用于对这些具有挑战性的样品进行成像,但该技术遭受光晕伪影,仅限于非常薄的样品制备,无法利用完整的聚光镜和物镜孔径。

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弗朗西斯史密斯于1955年首次设计的基本差分干涉对比(DIC)系统是一种改进的偏振光显微镜,增加了两个沃拉斯顿棱镜,一个用于聚光镜的前焦平面,另一个用于物镜的后焦平面(见图1)。几年后,波兰出生的法国物理学家乔治诺马斯基修改了标准沃拉斯顿棱镜配置,以使这些极薄的光学元件物理地远离孔径共轭平面。

微分干涉对比显微镜所需的光学元件不会掩盖或阻碍物镜和聚光器的孔径(如在相位或霍夫曼调制对比度中),从而使得仪器可用于全数值孔径其结果是分辨率(特别是沿着光轴)的显着提高,消除了晕轮伪影,并且能够用较厚的样本产生出色的图像。此外,微分干涉对比度产生的图像可以使用数字和视频成像技术轻松操作,以进一步增强对比度。

图1中显示的是用于荧光照明的现代透射光显微镜的典型差分干涉对比配置。基本的光学方案非常类似于用专用分束棱镜改装的传统偏光显微镜将偏振器和分析器分别插入冷凝器之前和物镜之后的光路中。在冷凝器转台组件中安装了几个分束棱镜(改进的Wollaston或Nomarski)棱镜,其设计用于容纳具有不同焦距和孔径尺寸的物镜,而单个Nomarski棱镜(兼容所有客观规格)位于定位在鼻镜中的滑块框架中。

与相位对比不同,微分干涉对比度将样本光程长度中的梯度转换为幅度差异,可以将图像中的对比度改善为可视化。样本光程差由光路上两点之间的光束穿过的折射率差(样本及其周围介质之间)与几何距离(厚度)的乘积确定。在微分干涉对比显微镜中产生的图像具有独特的阴影外观,就好像它们是从源自单个方位角的高度倾斜的光源照亮的。不幸的是,这种效应往往会使样品呈现出三维立体浮雕,

微分干涉对比显微镜与传统的双光束干涉仪器不同,主要是定性技术而非定量技术。样本由两个紧密间隔的部分相干但正交的波前采样,波前分开的距离略低于显微镜的横向分辨率。因为采样参考光束都横过样品(和/或周围介质)的相似区域,其被限制在小于2微米的空间间隔距离内,DIC将不会产生样品折射率或厚度的精确测量。相反,该技术对于确定相位梯度的方向以及利用全目标孔径来产生薄的光学部分是没有用的,所述光学部分不会遮蔽位于直接焦平面之外的标本特征的干扰。

在微分干涉对比中使用的波对由双折射分束器(Wollaston或Nomarski复合棱镜)在源自钨丝的相干光的平面偏振波阵面上的作用产生并聚焦到显微镜的前焦平面中聚光器(分光镜所在的位置)。当由分束器产生的一对相干光线遇到相位梯度时,由于折射率和/或厚度变化,每个光线将变形并且在穿过样本时经历稍微不同的光程差。从样品中出现时,光线将不同相。光学路径的差异被DIC显微镜转换成在目镜中观察到的最终图像中幅度的变化。然而,从简单检查图像,不可能确定样本中的相位梯度是否由于折射率或厚度(或两者)的差异而发生。这种不确定性是由于光程差来源于折射率和厚度的乘积并且缺少关于任一数量的独立信息这一事实,所以不能确定差异的起源。

在分束棱镜产生的波前通过样本相位梯度后,它们通过第二棱镜和分析器(另一个偏振器)的微分干涉重新组合以产生梯度的高对比度再现。微分干涉对比度和相位对比都依赖于采样和参考光束之间的样本相位差,以基于变化的幅度产生图像。相位对比度将图像振幅信息从样本衍射的光波与通过冷凝器环隙,样本和相位板的参考光束之间出现的相位变化转换而来。然而,区别地,DIC图像对应于从样本光程差获得的梯度分布的数学一阶导数而不是幅度。

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DIC显微镜中光路梯度和强度分布之间的关系如图2所示。图2(a)中显示的样本是一个圆环形人体红细胞,在高倍镜下以微分干涉对比成像,剪切轴由双倍带头的箭头(从西北向东南)。图2(b)显示了光程差(纵坐标)与红细胞直径沿剪切轴(横坐标)的关系曲线。请注意,光路轮廓反映了人体红血细胞呈现的薄中心和厚边缘。如图2(c)所示,当差分干涉对比度图像增加到常数时,强度扫描非常接近光程差曲线(图2(b))的一阶导数。红细胞光路轮廓中的正和负斜率分别在一阶导数扫描和对应的微分干涉对比图像中产生较高和较低幅度的区域。光路差分布曲线中没有斜率变化的区域具有与背景相同的强度并且对应于光程差的一阶导数图中的基线。

差分干涉对比度光学配置

精确匹配的光学元件在(或接近)共轭平面和显微镜内其他特定位置的精确配置对于差分干涉对比的配置方案至关重要(见图1)。所有主要制造商都提供高品质,精密的DIC光学附件,通常以套件形式销售,用于其倒立式立式研究显微镜。一般来说,只需要四个基本组件来配置研究或标准实验室明视野显微镜观察微分干涉对比度:

  • 线偏振器 - 插入显微镜光端口(或照明源聚光透镜之后的任何地方)和聚光透镜组件(见图1和3)之间的光路中,此组件设计用于产生干涉所需的平面偏振光成像。用于电矢量分量的振动平面透射轴以东 - 西方向(当站在显微镜前时从右到左)取向,这是典型的标准偏振光显微镜。一些差分干涉对比度设计在显微镜的该位置结合了旋转偏振器和四分之一波长延迟板。这些组件一起被称为deSénarmont 补偿器,并被设计为提供更精确的控制来调整图像对比度,这将在后面讨论。

  • 聚光器Wollaston或Nomarski棱镜 - 为了将从偏振器发出的偏振光分成两个分量,专门的分光棱镜(通常称为聚光棱镜)放置在聚光器虹膜光阑孔径的共轭焦平面内或附近,如图3所示。平面偏振光的入射波前由Wollaston或Nomarski棱镜分裂(或剪切)为相互垂直(正交)的偏振分量(称为普通异常波前)。

  • 目标Nomarski棱镜 - 位于物镜后面(图3),无论是在可调节滑动框架还是固定安装位置,都采用第二分光棱镜来重新组合物镜后物镜共轭平面中的剪切波前。这个成分是干涉和图像形成的关键元素,也被称为客观棱镜在大多数情况下,放置在聚光镜和物镜焦平面上的棱镜的设计和光学特性不同,以确保它们的干涉平面与光学共轭显微镜孔径平面一致。

  • 分析仪 - 第二个线性偏光镜安装在物镜棱镜后面,通常位于显微镜鼻镜和观察(目镜)管之间的中间管中。定位分析仪,该偏振元件位于管透镜(用于无穷远校正的显微镜)和图像平面(图3)之前的光路中。分析仪定向为电场矢量的透射轴垂直于(北 - 南)分极偏振器的透射轴。从物镜棱镜到达的圆偏振光和椭圆偏振光的分量通过分析仪,随后发生干涉,以在显微镜中间像平面(目镜固定光阑或相机系统投影镜头光阑)上生成DIC图像。

当Wollaston和/或Nomarski棱镜从差分干涉对比显微镜光学路径中移除时,光学配置等同于调整用于最大消光的标准偏振仪(正交偏振器)。由于DIC技术依赖于平面偏振光,所以双折射标本或应变光学元件可以通过在其他黑暗(或黑色)背景上产生未聚焦的亮区来干扰图像强度。为此,DIC显微镜配置应采用无应变物镜和(最好)聚光透镜元件。标准的显微镜物镜通常在镜片中包含紧密的镜片支架,遮挡物和双折射不均匀性而产生的玻璃应力特征。这些缺陷通常会导致对比度降低,这会对最终图像的保真度产生严重后果。此外,分离的波前(略低于衍射极限分辨率)的接近需要显微镜物镜的高精度规格,特别是在大放大倍率下,以实现该技术的全分辨率潜力。

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图3所示为通过典型DIC显微镜光学组件的主要部件和光路的理想化示意图。从灯丝的局部区域发射的相干波前通过偏振器以形成平行于由与偏振元件相邻的双箭头指示的轴线(相对于页面平面成45度)定向的线性偏振光。偏振波前会聚在沃拉斯顿组合棱镜所在的聚光镜前焦平面上。

在被棱镜剪切(下面讨论)之后,所得到的正交或相互垂直的波阵面被图示为一系列红色双箭头(平行于页面的波阵面)和蓝点(垂直于页面的波阵面)。一旦它们穿过样品中的光程梯度,波前就被物镜聚集,并聚焦在后焦平面上,第二个沃拉斯顿棱镜就位于此处。然后,重新组合的波前通过第二偏振器(分析器),该偏振器以偏振元件左侧的黑色双箭头指示的透射轴定向(相对于子冷凝器偏振器为90度)。请注意,聚光棱镜在图3中成像在物镜棱镜上,因此波前剪切在沿着棱镜表面的每个点(彼此相反)都是匹配的。沿剪切轴(垂直于显微镜光轴并与页面平行,如下所述)平移任一棱镜会产生在整个显微镜光圈内均匀的波前失配。

沃拉斯顿和诺马斯基棱镜

双折射Wollaston和/或Nomarski棱镜插入光学路径,其剪切轴以45度角(偏西北至东南)与偏振器和分析器相对。棱镜由两块精密研磨和抛光的楔形板组成,由高等级光学石英(一种单轴双折射晶体)制成。必须制造两个具有光轴垂直取向的石英楔,以制造单个Wollaston(或Nomarski)棱镜。楔形物在斜边处粘合在一起以产生光学各向异性复合板,其中第一楔形物的晶体学光学轴线垂直于第二楔形物的光学轴线。普通非凡的浪潮。

相互垂直的超常和常规分量波前是相干的,具有相同的幅度(原始偏振波的70.7%),并且通过沃拉斯顿棱镜的下半部以相同的方向行进。然而,波以不同的速度传播,这些速度由缓慢快速的介电性质定义下双折射石英晶体楔的轴。普通波沿快轴(具有较低折射率)通过棱镜行进,而非常光线穿过具有较高折射率的较慢轴。在石英中,快轴和慢轴之间的折射率差大约为0.6%,而快轴垂直于楔的晶轴定向。因此,普通波横穿垂直于光轴的石英楔形截面,而非常态波平行于该轴定向。

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波阵面的角度分裂或剪切发生在水泥石英楔之间的折射率接合处,并且波在空间上分离了被定义为剪切角的角度在这个边界,普通和非凡的波浪也交换身份(图4)。一个波前(普通)从低折射率介质传播到具有较高折射率的第二介质(上楔形),并根据斯涅耳定律向法线(垂直于楔形光轴)弯曲。第二波阵面(非凡)留下高折射率的介质并进入折射率较低的第二介质,将波前弯曲离开法线,但以与第一波阵面相同的角度弯曲。

无论入射点如何,棱镜面上的所有入射波前的剪切角和分离距离都是恒定的。波前剪切的方向由棱镜剪切轴定义,它位于沃拉斯顿棱镜的平面内,并平行于下石英楔形部分的光学(晶体学)轴(如图4所示)。结果,进入沃拉斯顿棱镜的一个偏振波前将平行于剪切轴的方向,而另一个垂直于该轴定向。剪切角度由棱镜组件的设计(石英楔角小于一定弧度)决定,不能在显微镜中调整。然而,剪切距离非常小(通常小于1微米),使得从棱镜出射的光中不会出现可观察的光束分离。

如上所述,在通过沃拉斯顿棱镜中的下石英楔的过程中,普通和非凡的波阵面经历不同的折射率。结果,普通波前以比非常波前更高的速度传播通过晶体。当波前在下部和上部石英楔之间的界面处交换身份时,普通波前变成非常波前,反之亦然。另外,当通过沃拉斯顿棱镜的下半部分和上半部分的几何路径相同时(图4),波阵面在棱镜下半部分经历相移(由于折射率差异),其在上半部分被精确地补偿(b))。从中心穿过棱镜的波阵面在经过剪切前的下棱镜楔块(图4(c))或经剪切后的上楔块(图4(a))经过更长的行程,然后退出。通过波阵面穿过单棱镜楔的延伸距离最终使其中一个波(普通(图4(a))或非常(图4(c))到达石英 - 空气界面之前。在棱镜面上,每个单位长度的恒定相移发生在剪切方向上,对于普通和异常波前(图4(a)和4(c))是相等但相反的。棱镜的非常波前出现在普通波前,而在另一端的相应位置,

如果入射在沃拉斯顿棱镜上的波前在平行于剪切轴的方向上被极化,则不会发生波前的正交分裂,并且平面偏振光将从棱镜中出现。同样,如果入射偏振波阵面垂直于棱镜剪切轴定向,它也会相对于定向从棱镜出射。当入射偏振波阵面与棱镜的剪切轴成45度角时,出现理想情况(并且对于微分干涉对比显微镜是必要的)。从这个角度入射的线偏振光的电矢量被平分成两个分量矢量,每个矢量在石英晶体的快轴或慢轴的平面内振动,并且具有原始波阵面的均方根(70.7%)幅度。沃拉斯顿和诺马斯基棱镜都表现出取向依赖性。以45度角进入棱镜相对侧(此时从顶部)的准直线性偏振光束也将产生正交的非常规和普通波前。但是,波浪的极化将会颠倒。

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当一个Wollaston或Nomarski棱镜夹在两个交叉的偏振片之间,并通过透过两个偏振片和棱镜的光进行检测时,可以观察到带有主要中心黑带(条纹)的平行干涉条纹图案(如图5所示)。这些图案是由棱镜表面上出现的倾斜的普通和非凡波阵面之间的干涉引起的。在中心黑暗干涉条纹的左侧和右侧,周边条纹显示经典偏振干涉色谱的增加阶数。设计用于具有不同焦距和数值孔径的物镜的棱镜楔以越来越小的角度(如放大率和数值孔径增加)切割以产生更窄的干涉条纹带。

如果将一阶补偿器(红色平板)添加到交叉偏振片三明治夹层的对角线位置(图5中未示出),则黑色边缘会被替换为干涉颜色,其中一边显示减法(黄色),另一边显示加法(蓝色)在原始黑暗边缘位置的另一边。在第一个棱镜的顶部添加第二个Wollaston或Nomarski棱镜将补偿第一个棱镜在整个长度上的相移(和产生的干涉条纹),导致消光(如图5所示;请注意,只有在用于实验的两个棱镜具有相同的剪切角)。通过将一个棱镜相对于另一个横向平移,产生均匀的偏差,或路径长度的变化,将被引入并可通过三明治进行观察(图5)。向一个方向滑动棱镜会变暗,然后使棱镜变亮,而向另一个方向滑动棱镜会产生一系列均匀的干涉色(从一阶黄色开始)。

干涉条纹在夹在两个偏振器之间的Nomarski棱镜中观察到,似乎漂浮在棱镜上方几毫米的空间中。但是,当使用沃拉斯顿棱镜观察相同的条纹时,它们似乎位于棱镜内部。Nomarski和Wollaston棱镜的干涉条纹的位置称为干涉平面由于传统Wollaston棱镜中的干涉平面位于棱镜的中心部分,大约位于楔子之间的中心线上(图6),因此很难调整沃拉斯顿棱镜以用于标准显微镜物镜。出现这个问题是因为棱镜的干涉平面必须与后焦平面(也称为衍射平面)重合并重叠),通常位于玻璃透镜元件内的螺纹安装座下方。

大多数制造商通过采用Nomarski(偶尔称为改良Wollaston)来规避目标光圈清除问题)棱镜分别用于光束剪切和冷凝器和物镜焦平面中的复合任务。由于采用了专门的设计,如下所述,Nomarski棱镜的一个干涉平面可以移动到棱镜外几毫米的位置,而不像传统的Wollaston设计那样跨越楔形元件。Nomarski棱镜不需要物理定位在物镜或聚光镜焦平面上,但可以定位在一定距离处。尽管Nomarski棱镜不能产生更好的对比度,但它们避免了视场中可能出现干涉条纹的潜在问题。应该指出的是,徕卡显微系统曾经生产出一种被称为Smith T的流行显微镜微分干涉对比系统,将标准沃拉斯顿棱镜纳入专门设计的物镜。但是,这种设计策略是罕见的例外,而非规则。

Nomarski棱镜就像沃拉斯顿棱镜一样,由斜边上粘合在一起的两块光学石英楔构成。其中一个楔子与传统的沃拉斯顿石英楔相同,并且光轴的取向平行于棱镜表面。然而,通过以这样的方式切割石英晶体来修改第二楔形,即光轴相对于棱镜的平坦表面倾斜地定向。当楔形物组合形成双折射复合棱镜时,焦平面(以及当偏振光通过棱镜时产生的干涉条纹)位于棱镜板的外部,如上所述和图6所示。这种效应的发生是因为剪切现在需要放置在下楔块的空气 - 石英界面处,并且在石英楔之间的界面处的折射导致剪切的波前与棱镜外的交叉点会聚。Nomarski棱镜焦平面的实际位置可以通过改变用于构建棱镜的第二个石英楔中光轴的倾斜角在几毫米的范围内进行调整。

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尽管Nomarski棱镜在现代微分干涉对比显微镜中被广泛用作客观棱镜,但是聚光棱镜的空间约束更少,通常可以精确定位在孔径平面内。因此,传统的沃拉斯顿棱镜有时可以插入显微镜聚光镜,但在许多情况下,使用Nomarski棱镜代替。在冷凝器中使用Nomarski棱镜时,棱镜设计的目的是为了产生比棱镜更接近棱镜的干涉平面。因此,除了安装在具有不同几何形状的框架中之外,在现代DIC显微镜中发现的两个Nomarski棱镜被切割得不同并且不可互换。总之,对于微分干涉对比显微镜,次级辅助,或补偿化合物棱镜)充当主分束器来剪切偏振波前,而目标棱镜(在棱镜)重组分离的波并调节正常和异常波前之间的相位差的程度。

请务必记住,将显微镜对准科勒照明是确保Nomarski棱镜干涉平面与冷凝器和物镜的共轭孔径平面一致的正确定位的关键和必要步骤。当Nomarski棱镜放置在正交偏光镜之间时(如上所述),可以使用中心或零阶干涉条纹来确定显微镜对准过程中棱镜的正确定向。

DIC波前关系与图像形成

在孔径平面从冷凝器Wollaston或Nomarski棱镜出射后,剪切的普通和非常相干波前由聚光器的透镜元件聚焦并在被物镜收集之前穿过样本。沿着它们在冷凝器和物镜之间的轨迹,波前保持相互平行并且被剪切距离分开来自冷凝器棱镜的几何约束。波前(剪切距离)之间的空间分离随着聚光镜和客观数值孔径而变化,但具有0.1至1.5微米的实际限制,线性范围被设计为略小于(或在某些情况下等于)横向分辨率的目标。通过将剪切距离减小到物镜最大分辨率的一半左右,可以增加差分干涉对比度的分辨率(以对比度为代价)。

大多数显微镜制造商在剪切距离与分辨率(和对比度)折衷方面存在妥协,并产生对于较低放大倍率物镜(10x)具有约0.6微米的最大剪切距离的棱镜,对于较高放大倍率物镜,最小接近0.15微米(60x和100x)。然而,无论剪切距离如何,重要的是要注意,在整个显微镜孔径上空间分布的紧密间隔的波前对,对样本中的每个点进行采样,以最终在图像平面处提供双光束干涉。

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当不受样本存在的干扰时,相干波阵面对在样本和图像平面之间经历相同的光程差,并到达与离开聚光器时具有相同相位关系的物镜后焦平面。位于物镜后方的Nomarski棱镜将客观焦平面中的波前重新组合,以产生具有与底偏振器透射轴相同的电矢量振动取向的线性偏振光。离开物镜棱镜的线性偏振波前被第二偏振器(或分析器)阻挡,该透镜轴的透射轴取向垂直于偏振器(图7(a)和7(b))。结果,在视场中观察到的图像背景显得非常暗或黑,这种情况称为灭绝

没有样品引起的相移,聚光棱镜的分束作用被目标Nomarski棱镜的光束复合效应精确匹配和反转,最终产生线性偏振光。换句话说,当显微镜正确配置科勒照明(高分辨率差分干涉对比显微镜的关键先决条件)时,聚光镜和物镜共同操作,将光源和聚光棱镜的图像投影到物镜棱镜上。目标Nomarski棱镜相对于聚光棱镜方向颠倒,引入了相移,该偏移精确地补偿了聚光棱镜产生的波前之间的线性相移。这个动作发生在整个显微镜光圈的所有成对波前。聚光镜和物镜棱镜的轴相互平行,并相对于正交偏光镜(偏光镜和分析仪)的透射轴成45度角。两个棱镜的定向轴被称为是一个重要的概念,它定义了从离开聚光镜棱镜到被物镜棱镜重新组合并到达像平面的普通和非常波前之间的横向分离轴。

如果相干成对波前遇到样品中存在的相位梯度,同时从冷凝器到物镜,则会引起波前畸变,并且波会沿着剪切轴发生相移并穿过稍微不同的光路(尽管没有变化发生极化)。到达客观棱镜后,相移的成对波前重新组合以产生椭圆偏振光(与不存在样品时产生的线性偏振光相反)。合成波前的电矢量不再是平面的,在它穿过物镜棱镜和分析仪之间的区域时(如图7(c)所示)扫描出椭圆路径。

总之,试样中的光程梯度引起相干成对波前的相移,这些相干成对波前由聚光棱镜剪切并通过平行轨迹。这些相移被目标Nomarski棱镜转化为相位差,产生椭圆偏振光,能够使线性分量通过分析仪并产生图像。事实上,在整个样本场中,相位梯度的存在或不存在产生线性和椭圆偏振波阵面的组合,其被分析器根据其振动平面的方位选择性地传递。能够穿过分析仪的波前都是平面平行的,并且可以通过图像平面处的干涉产生样本的振幅图像。当客观棱镜恰好补偿了聚光棱镜的影响(就像它在科勒照明中那样),分析仪阻挡源自缺乏相移的场的所有空间位置的波前(没有样本相位梯度)。除了显示陡峭的标本折射率或厚度梯度的区域之外,在视场中观察到的背景是黑暗的(表现出全部消光),该区域看起来更明亮(通常为轮廓形式)。感知图像看起来与经典,简单的暗场照明技术生成的图像非常相似。除了显示陡峭的标本折射率或厚度梯度的区域之外,在视场中观察到的背景是黑暗的(表现出全部消光),该区域看起来更明亮(通常为轮廓形式)。感知图像看起来与经典,简单的暗场照明技术生成的图像非常相似。除了显示陡峭的标本折射率或厚度梯度的区域之外,在视场中观察到的背景是黑暗的(表现出全部消光),该区域看起来更明亮(通常为轮廓形式)。感知图像看起来与经典,简单的暗场照明技术生成的图像非常相似。

这些概念在图8中以图形方式描绘,图8表示剪切波前通过相位样本(具有比周围介质更高的折射率)和它们在图像平面处的相应振幅(或强度)分布之间的相位关系。通过样品的相互垂直的波前(标记为Σ(1)Σ(2) ;参见图8(a))失真并显示局部相位延迟区域(称为差分相位延迟)。目标Nomarski棱镜通过消除由聚光棱镜引入的角波剪切而重新组合波前,在该过程中产生波前变形的横向位移。如图8(a)所示,当双棱镜仪器配置调整到最大消光时,图像平面沿剪切轴重建的畸变波前轮廓(对于非常和非常分量)。在纵坐标上显示由试样引入波前的相位延迟(φ)(以纳米测量),而沿剪切轴(x的倾角宽度代表放大的试样直径(在这种情况下,单个液滴油)。

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在图8(a)中的相位延迟波前透过分析仪并在图像平面上通过相长干涉和相消干涉重新统合后,得到的强度分布可以表示为沿着剪切轴的幅度曲线(图8( b))。对于本例中考虑的对称油滴试样,幅度曲线作为穿过剪切轴的距离的函数,会产生一个黑色中央空腔,两侧各有明亮区域(见图8(b))。在显微镜中观察到的实际样本的数字图像(图8(c))揭示了具有在黑色背景上叠加的明亮边缘和以中心为中心的黑色干涉条纹的球形微域。图8所示的图像记录在配有DIC光学系统的直立式显微镜上。

偏置延迟介绍

在差分干涉对比度显微镜调整为最大消光时,视场呈现为黑色,几乎黑色的背景,并且对具有增加和减小相位梯度的样本区域表现出非常高的敏感度。如图8(c)所示,在这种配置中,一些样本细节被遮蔽或很难分辨,并且通常可以观察到零阶干涉条纹穿过突出显示的特征。实际上,目标Nomarski棱镜沿剪切轴横向偏移,以均匀地移动通过样本的普通和非常波前的相对相位位移。因此,从物镜棱镜出射的光的偏振矢量取向可以从线性经过各种椭圆度甚至圆形调整。在DIC显微镜中引入偏差延迟

由于目标Nomarski棱镜横向移动(无论是显微镜光轴的左侧还是右侧),有助于背景的波前像对彼此变得越来越迟缓和异相。结果,进入分析仪的波前椭圆偏振度增加,背景强度逐渐从黑色变为中等,灰度变浅。另外,偏置延迟的引入改变了零阶干涉条纹的位置并且对样本中相位梯度的强度水平产生了相应的变化。这些产生了取决于取向的明亮高光和暗阴影叠加在现在较亮的背景上(具有通常称为零阶灰度的颜色)。最终的DIC图像不依赖于仅通过平移物镜棱镜引入的光程差,并且当聚光镜棱镜沿着显微镜光轴移动时可以获得相同的结果。然而,在大多数仪器中,通过改变物镜棱镜的位置而不是放置在冷凝器转台中的棱镜来产生偏置延迟要方便得多。

通过改变偏差延迟而引入样品的强度梯度沿着冷凝器和物镜棱镜的剪切轴发生,并且一般看起来是源于45度角(从西北到东南,反之亦然),当观察样品在目镜(见图8(f))。请注意,图8(f)所示的梯度是用直立显微镜记录的。倒置显微镜产生垂直于在直立显微镜中观察到的强度梯度。向一个方向或另一个方向移动棱镜将影响干涉条纹偏移,并改变普通和非常波前之间的相位关系(延迟或超前),从而颠倒标本中的阴影投射方向。

引入偏置延迟的最终结果是使样本图像呈现伪三维浮雕,其中增加光程差(倾斜相位梯度)的区域看起来更明亮(或更暗),而呈现减小的路径长度的区域则反过来呈现。根据相位梯度方向,样品的特征看起来类似于高架平台或凹陷的凹陷,这是微分干涉对比的一个显着特征。但是,三维外观只与相位梯度相对应,不应与实际样品几何形状相混淆(情况往往如此)。在某些情况下,真实的地形特征也是改变相位梯度的地点,但在没有作为独立调查结果获得的信息的情况下,

在图8(d)至图8(f)中,对于由几个半球形油滴组成的相样本,在微分干涉对比显微镜中引入偏差延迟。当显微镜调整到最大消光时,普通和非常波前沿剪切轴显示相移,但在与背景相对应的区域不显示相位差(图8(a))。通过平移目标棱镜增加偏置延迟可以使一个波前相对于另一个波前的相对相位偏移(图8(d)),但波前剪切保持不变。在图像平面发生干涉时,作为剪切距离(图8(e))的函数绘制出的幅度(或强度)在油滴的一侧显示亮边缘区域,在相反侧显示暗区域。在显微镜下观察时,样品表现出阴影效果,好像它是从高度倾斜的角度照射的(见图8(f))。为了观察最大消光与偏差延迟的增加之间的差异,比较图8(c)和(f)中呈现的样本图像。通过在相反的方向上平移相同量的物镜棱镜,可以反转取决于剪切轴的阴影取向(图8(c)和(f)中的双头箭头)。为了观察最大消光与偏差延迟的增加之间的差异,比较图8(c)和(f)中呈现的样本图像。通过在相反的方向上平移相同量的物镜棱镜,可以反转取决于剪切轴的阴影取向(图8(c)和(f)中的双头箭头)。为了观察最大消光与偏差延迟的增加之间的差异,比较图8(c)和(f)中呈现的样本图像。通过在相反的方向上平移相同量的物镜棱镜,可以反转取决于剪切轴的阴影取向(图8(c)和(f)中的双头箭头)。

通过使用位于安装框架末端的微调旋钮(通常位于显微镜鼻架外壳或中间管内)沿着光轴来回移动物镜Nomarski棱镜,传统上将偏差引入差分干涉对比显微镜, 。越来越流行的替代技术是在偏振器和聚光棱镜之间以固定方向安装四分之一波长延迟板(称为deSénarmontDIC补偿)。在最大消光时,延迟板的快轴与偏振器的透射轴对齐,并且两个光学单元可以(并且通常)被包含在显微镜基座的相同外壳内。目标棱镜和分析仪之间的deSénarmont补偿器的替代位置,在配有适当中间管的显微镜中。

为了使用deSénarmont补偿器引入偏置,偏振器透射轴相对于延迟板的快轴旋转(高达正负45度),其相对于分析仪保持固定在90度角传输轴。当补偿器快轴与偏振器的透射轴重合(平行)时,只有线偏振光通过deSénarmont补偿器到达聚光棱镜。然而,当偏振器透射轴旋转时,从四分之一波长延迟板出现的波前变为椭圆偏振。在一个方向上旋转偏振器将产生右旋椭圆偏振光,而沿另一方向旋转偏振器将改变矢量轨迹以产生左旋椭圆扫描。

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当偏振器透射轴的取向达到正或负45度(相当于四分之一波长延迟)时,通过补偿器的光变为圆偏振(再次以左手或右手方向)。由于椭圆或圆偏振光代表从deSénarmont补偿器出现的普通和异常波前之间的相位差,所以当波前进入聚光棱镜并被剪切时,偏置被引入系统。当偏振器沿一个方向旋转时获得正偏置,而通过沿相反方向旋转偏振器引入负偏置。

无论偏差是通过平移目标Nomarski棱镜还是通过旋转deSénarmont补偿器上的偏振器而引入差分干涉对比系统,最终结果都是相同的。正如前面所讨论的那样,在正确配置的Köhler照明显微镜中,光源和聚光棱镜的图像通过光学系统(聚光镜和物镜)传输到位于物镜后焦平面的反向第二个Nomarski棱镜上。物镜棱镜中的相反相移精确补偿了聚光棱镜表面的线性相移。客观棱镜沿剪切轴的平移不会改变相移分布,而是在整个显微镜光圈上增加或减少恒定的相位差。以相同的方式,在deSénarmont补偿器中旋转偏振器也引入了可变的和受控的相位差。匹配的棱镜系统使得对于从聚光器孔径投射的每个波阵面对,以相同的偏差延迟发生图像形成,而不管其穿过样本到达物镜的路线。

图9所示是在DIC中记录的一系列数字图像,使用几个中间步骤中的二十分之一至四分之一波长的偏差延迟范围。标本是一个15微米的固定和安装的小肠部分,其中包含厚度波动区域。样品细节的再现和阴影伪三维效应在较低的偏置延迟值(图9(a)和9(b))下最显着,但细小样本细节的对比度和定义均随着偏差延迟(图9(c)至9(f))。在最高偏置延迟值(四分之一波长;图9(f))下,对比度极差,并且很少看到结构细节。对于这个特定的标本,

随着样品中的光程梯度增加,图像对比度也增加。在不同程度上改变偏差延迟也可以在目镜中观察到样品产生显着的对比度波动(图9)。一般来说,由目标棱镜平移引起的普通和非常波前或通过在德塞纳蒙补偿器中旋转偏振器的最佳位移程度大约小于十分之一波长。然而,这个值在很大程度上取决于样品的厚度,而生物样品偏置延迟的有用范围介于三分之一到四分之一波长之间。具有非常大的光学梯度的样本中的对比度通常可以从甚至更大的偏置延迟值(达到全波长)受益。


补偿器延迟板在DIC显微镜

微分干涉对比度中的普通和非常波前之间的偏差延迟也可以通过使用最初作为定量延迟测量设备和用于偏光显微镜的对比增强元件的补偿器来操纵。补偿板可以更好地控制样品细节对比度与背景强度和颜色值的对比,还可以更精确地调整波前的偏差值。这些双折射元件也经常用于透明样品的光学染色,通常在有限的灰度值范围内进行染色

当标准物镜Nomarski棱镜沿着显微镜光轴沿四分之一波长的路径差异平移时,样品特征和背景都会获得类似于偏振光显微镜中观察到的牛顿干涉色谱。标本和背景变成光学染色,颜色转变通过白色,黄色,红蓝色和更高阶迁移通过一系列灰度值。光学染色产生戏剧性和美丽的彩色图像,但对科学应用的用途有限。通常,最佳标本对比度被限制在延迟的二十分之一至四分之一波长的范围内。

补偿器可以插入到DIC显微镜的光学路径中,在目标棱镜和分析仪之间或者偏振器和聚光棱镜之间。许多显微镜有一个位于为此设计的中间管或分室冷凝器外壳中的槽。增加一阶补偿器(通常称为全波一阶红)其具有等于可见光的绿色区域(大约550纳米)中的全波长的延迟值,将干涉色的光谱引入样本和背景。使用补偿器后,绿光不能通过分析仪,因为它是从具有与偏振器相同取向的电场矢量线性偏振的延迟板出现的。然而,红色和蓝色光谱区域的波前经历的延迟小于一个波长,并且变成椭圆偏振,允许它们通过分析器。结果,这些颜色变得混合在视野中形成洋红色背景。

因此,当使用微分干涉对比度光学系统和一阶补偿器在白光下观察样本时,背景显示为洋红色,而图像对比度以二阶蓝色和一阶黄色(取决于方向)显示牛顿干涉色谱。使用补偿器后,通过平移Nomarski棱镜(或旋转deSénarmont补偿器中的偏振器)而获得的偏差延迟的小变化对具有大光学相位梯度的结构中观察到的干涉色产生快速变化。该技术对于向具有高折射率边界的区域(例如细胞膜,大细胞内颗粒,纤毛和细胞核)引入颜色(光学染色)是有用的。

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图10中示出了几个透明标本,它们已经通过DIC光学技术被光学染色并呈伪三维浮雕。图10(a)描绘了在一个ctenoid鱼鳞边缘的投影,而图10(b)显示了犬钩虫(Ancylostoma caninum的嘴大豹蛾(Ecpantheria scribonia)如图10(c)所示。在所有情况下,Nomarski棱镜均在显微镜光轴上平移至超过全波长的偏置延迟值。虽然这些图像没有揭示与标本有关的隐藏科学信息,但它们确实有可能推进DIC光学显微镜技术作为科学与艺术之间的合法桥梁。

在配备有德塞拿蒙补偿用于将偏压成差分干涉对比光学系统的显微镜,可以加入一个全波相位差板在光学上与染色牛顿干涉色试样,并提供有关路径差异的详细的定量信息。如上所述,deSénarmont补偿器经常在DIC显微镜中使用,以获得精确测量的偏置延迟水平,但该设备也可用于监测光学部件的对准。在视频增强型DIC显微镜中,deSénarmont补偿器通常用于优化标本细节的对比度,其低于显微镜的分辨率极限。

解释DIC图像

利用微分干涉对比显微镜获得的图像中最显着和公认的方面是高度可见的缓解,通过阴影效应表现出来,这种效应赋予伪三维实在性。一般来说,标本通过高角度倾斜的光源从低角度照亮,这让人想起使用传统斜向照明或霍夫曼调制对比获得的结果。然而,谨慎地说,应该总是理解图像,理解阴影演播中的阴影和高光仅指示相位或光路梯度的符号和斜率方向,并且不一定揭示精确的几何或地形参数。

通过观察通过偏置延迟产生的几乎每个图像中存在的阴影投射取向,光剪切的方向是明显的并且可以精确地定义为显示最高和最低强度值的轴连接区域。需要考虑的另一个考虑因素是样本与其周围介质之间的关系,因为对于具有比其周围更高或更低折射率的样本细节,阴影方向通常是相反的。因此,细胞核,核仁,线粒体,丝状体,中期染色体和溶酶体等致密的亚细胞颗粒通常表现出凸起的隆起(山顶),而较低的折射率包含体(例如,胞饮囊泡,水性空泡,

通过差分干涉对比度赋予样本相位梯度(以及拟三维度)的对比度水平是通过平移Nomarski棱镜或在deSénarmont中旋转偏振器而引入光学系统的偏差延迟量的函数补偿。由于剪切轴通过Nomarski和Wollaston棱镜设计以及波前方向对微分干涉对比度产生的其他限制进行了固定,因此通过显微镜上的简单设置,不会改变轴方向以影响样本对比度。然而,通过将目标棱镜从显微镜光轴的一侧重新定位到另一侧(将偏差延迟从负向移动到正向,可以逆转普通和异常波前之间的相对相位延迟,或相反亦然)。此操作也可以通过将偏光片旋转到deSénarmont补偿器上相应的负值来完成。当相位延迟如上所述改变时,样品上明亮和黑暗边缘的取向反转180度。从本质上讲,显微镜专家可以改变剪切轴相对于试样的唯一机制是重新定向试样本身,这是一种利用圆形360度旋转台(主要设计用于偏光显微镜)的机动。

在微分干涉对比度图像中,沿着显微镜的剪切轴的阴影和高光强度最大,并且具有与背景相同的恒定折射率显示强度值的区域。当从几个方位角检查具有球形几何形状的试样(图8(f))以便在与背景接壤的边缘处进行对比时,发现在垂直于剪切轴的区域中对比度最小。事实上,样本和背景之间的对比度差异逐渐减小,直到它们在定义零阶干涉条纹轴(垂直于剪切轴)的方向上达到最小值。在图8(c)和8(f)中,表现出最低对比度(由未标记的白色箭头表示)的样本区域是精确垂直于剪切轴的油滴中心区域的边缘。为了验证这个概念,比较干涉条纹在最大消光时记录的图像中的背景(图8(c))与引入偏差延迟后产生的图像中的对应区域的比较(图8(f)), )。在由未标记的白色箭头标记的区域中,普通和非常规波前失真具有对齐的轮廓,其在分析器处被减去以消除残余延迟并产生与背景完全匹配的强度值。将干涉条纹在最大消光(图8(c))处记录的图像中与背景相遇的边缘与引入偏差延迟后产生的图像中的相应区域(图8(f))进行比较。在由未标记的白色箭头标记的区域中,普通和非常规波前失真具有对齐的轮廓,其在分析器处被减去以消除残余延迟并产生与背景完全匹配的强度值。将干涉条纹在最大消光(图8(c))处记录的图像中与背景相遇的边缘与引入偏差延迟后产生的图像中的相应区域(图8(f))进行比较。在由未标记的白色箭头标记的区域中,普通和非常波前失真具有对齐的轮廓,其在分析器处被减去以消除残留延迟并产生与背景完全匹配的强度值。

在微分干涉对比显微镜中检查的每个样品将具有最佳的偏差延迟设置,其在最终图像中产生最大对比度水平。表现出较低折射率梯度的非常薄的标本(例如培养中的活细胞)通常受益于同样低的偏置设置,该偏置设置仅略大于样本中存在的最大相移(约为波长的二十分之一,或大约30纳米)。然而,较厚的样品通常需要在较大的聚光器孔径处使用较高的偏置设置(高达四分之一波长),以产生令人满意的结果,通常通过光学切片。由于许多标本由显示各种不同尺寸和折射率的特征组成,

图11给出了微分干涉对比中取向现象的方位角效应。在所有情况下,剪切轴指向西北至东南,但在各个数字图像上未指示。图11(a)和11(b)示出孔隙和条纹由来自硅藻一个安装硅藻细胞表现出的周期性间隔布纹attenuatum当硅藻壳的长轴方向垂直于剪切轴(图11(a))时,孔似乎合并成一系列紧密间隔的脊并且不能单独解析。相反,在平行于剪切轴的方向上重新定向硅藻壳,揭示了该物种中孔结构的旋钮状几何形状。

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图11(c)给出了包含淡水(水蚤)的鳃肋的胸部区域在这个方向上,单独的肋骨结构清晰可见(垂直于剪切轴)并连接到普通的脊柱上,这种脊柱似乎是一系列平行于剪切轴的旋钮。当标本旋转90度(图11(d))时,大部分肋骨结构失去对比,脊柱隆起融合成一个脊。最后,ctenoid鱼鳞中的内含物缺乏对比度,当叠加在条纹体刺上时很难区分(图11(e))。旋转标本以使脊柱与剪切轴平行(图11(f))会降低它们的对比度并使得内含物清晰可见。


调整偏差延迟以产生最佳标本对比度时,应考虑许多因素。为了最大限度地使样品的一个斜面或边缘变暗而必须引入的偏差水平也会在样品和背景之间产生最大可能的对比度。因此,对于每个样本,一个特定的目标棱镜(或deSénarmont补偿器)设置通常会引入最大程度的对比度。超过此值时,对比度会降低。较厚的样本经常遭受光散射伪影,通常需要比较薄的样本更大的偏置延迟设置(达到全波长),以在具有显着相位梯度的区域中获得消光。最后,当冷凝器中的可变光圈开口尺寸超过物镜后孔径的75%时,由于光学系统中的光散射过度而导致对比度降低。考虑到这一困难,打开聚光器光圈进行光学切片实验时要小心。

光学切片

微分干涉对比样品的能力与大聚光镜和客观数值孔径的对比使得能够从聚焦图像创建非常浅的光学部分。如果没有光晕扰动和从焦点移除的侧向平面中明亮区域分散的强度波动,该技术可以产生清晰的图像,从复杂的三维相位样本上整齐地切割出来。这种性质通常用于获得复杂组织中细胞轮廓的清晰光学切片,而焦平面上方和下方结构的干扰最小。

在所有传统形式的透射和反射光学显微镜中,聚光器孔径虹膜光阑在定义图像对比度和分辨率方面起着重要作用。缩小光圈大小可增加景深和整体图像清晰度,同时增强对比度。但是,如果光圈太靠近,衍射伪影就会变得明显,并且牺牲分辨率。通常,最佳光圈设置是精确地呈现足够对比度的标本细节和保留分辨特征所需的分辨率,同时避免衍射伪影之间的折中。

高性能差分干涉对比显微镜光学系统与聚光镜虹膜光阑部分关闭(约为物镜后孔径大小的70%)产生良好的对比度,但在光阑打开以匹配物镜孔径尺寸时也表现出色。为了实现光学切片的分辨率和对比度之间的最佳平衡,显微镜必须正确配置科勒照明,棱镜组件和偏光镜应精确对准。设计用于油浸的高数值孔径物镜只能用于对底部涂油冷凝器的样品载玻片进行成像。

在高放大率和数值孔径(例如100x和1.4)下,差分干涉对比度中的景深接近约400纳米(0.40微米;约1.5倍目标横向分辨率极限)的极限值。在高放大倍数(100倍物镜)和数值孔径(1.30)下通过人颊上皮细胞中心区域的光学切片如图12所示。细胞在核附近大约3微米厚,并且配置的景深用于获得图12中的图像约为0.5微米。在细胞的上表面清晰可见细菌(图12(a)),平行的,在膜上旋转的脊与人类指纹纹理非常相似。在图的下部中央部分也可看到对应于核的膜的凸起。随着焦平面转移到细胞内部(图12(b)),核结构和细胞内颗粒的细节变得可见。最后,在细胞膜停留在显微镜载玻片表面的下边界处(图12(c)),显露出许多折叠的脊(类似于在上表面观察到的那些)。

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当使用较厚的生物样本(特别是浸入盐水溶液中的生物样本)进行光学切片实验时,显微镜专家必须警惕在盖玻片和封固介质之间的界面上可能引入由折射率不连续性产生的球面像差。这些伪影会降低光学剖面系列中较高穿透深度的分辨率。

目前微分干涉对比理论的研究和发展的大量重点在于该技术的突出光学切片特性。最终,通过计算模型可以实现样品的三维折射率分布的定量估计。此外,目前的研究还针对正在开发的用于DIC光学元件的新模型和部分相干透射光中的图像形成。

结论

微分干涉对比显微镜基本上是一种光束剪切干涉系统,其中参考光束被剪切很少量,通常略小于艾里斑的直径。实际上,样品中的每个点都由最后一张图像中的两个重叠艾里磁盘表示,其中一个较亮,另一个比背景更暗。基本的显微镜系统,首先由弗朗西斯史密斯1955年设计,是一种改进的偏振光显微镜,增加了两个沃拉斯顿棱镜,一个用于冷凝器的前焦平面,另一个用于物镜后焦平面。

后来的修改,乔治Nomarski建议,使棱镜物理位置远离光学孔径共轭平面。聚光棱镜将照射试样的每个波前转换为相互正交偏振的两个稍微偏移的平行光束,而物镜棱镜用来重新组合光束。通过光学系统相互镜像的这两个棱镜的组合是差分干涉对比度在高数值孔径下形成清晰图像的关键特征。

通过样品的几何路径长度或折射率的梯度将相位差引入两个正交波前,这导致离开目标沃拉斯顿棱镜的复合光束的椭圆偏振。可以通过沿着显微镜光轴平移物镜棱镜或通过将四分之一波长板与偏振器或分析仪相结合来将偏置延迟引入系统。因此,通过控制旋钮的简单旋转可以获得最佳对比度,场亮度和灵敏度。

生成的DIC图像具有阴影投射外观,可有效显示低空间频率和高空间频率的光路梯度。那些光路沿参考方向增加的样本区域看起来更亮(或更暗),而路径差异减小的区域则呈现出反向对比。光程差的陡峭梯度会导致更大的对比度。各种各样的标本都适用于微分干涉对比度的成像,包括非常细的细丝或尖锐的界面,即使它们的直径低于光学系统的分辨率极限时也能产生良好的对比度。

差分干涉对比显微镜的主要成像优势在于,与暗视野或相位对比不同,较小标本特征的图像不会被邻近的具有大光梯度的区域遮挡。此外,图像在中性灰色背景上的阴影投影外观,加上对非常小的特征进行成像的灵敏度以及更大的特征(例如对活细胞或动态内含物的分钟附属物和细胞内的移动细胞器)与传统的相衬技术相比,是一项重大改进。除了广泛的对比度控制动态范围和浅景深之外,这些优势都促成了该技术的广泛普及。

DIC显微镜的对比度是定向的,沿剪切轴呈现最大值,在正交方向呈现最小值。艾里磁盘分离的方向(平均磁盘半径的二分之一到三分之二的峰间距离)与显微镜的剪切轴一致,后者是最大对比度的方向。因此,DIC对比度传递函数(CTF)也是沿着剪切轴的方向。穿过样本的两个波前之间的横向位移大约是目标分辨率极限的一半。由Wollaston或Nomarski棱镜引起的这种小程度的剪切作用与用于样品中空间频率细节对比的高通滤波器类似。相应的调制传递函数(MTF)紧密地遵循在高空间频率下在明场照明中观察到的结果,但对于超过几微米大小(较低空间频率)的样本特征显示急剧下降。

适用于在DIC中观察的样本包括流体涂片,活细胞培养物,血细胞,亚细胞器,未染色的组织,染色体,原生动物,胚胎,硅藻,聚合物,复制品以及相对厚或超薄的切片切片。其他信息可以通过检查振幅和混合相位幅度样本获得,如天然色素原生生物,藻类和轻微染色的组织标本。该技术通常与荧光显微镜结合使用以揭示与荧光区域相关的细胞形态。当与增强视频技术(称为VEC-DIC 对于视频增强对比差分干涉对比度),可以利用DIC来产生具有低于显微镜的光学分辨率的尺寸的结构的图像。


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