如何选择合适的荧光滤光片

2018-08-17 16:53:35 普赫 1404

荧光成为生命科学的重要研究工具不是偶然的。因为激发光和发射光波长不一样,因此可以将漫散射光和特异性荧光分开,只成像特异性荧光区域,从而实现特异性分子级功能研究。
将激发光/漫散射光和特异性荧光区分开的工具就是滤光片。滤光片广泛存在于使用荧光的科研仪器中,比如荧光显微镜、流式细胞仪、RT-PCR等。
显微镜中,滤光片通常存在于一个小方盒子中,如下图:




如果我们打开这个盒子,会发现里面有三个不同的滤光片,其中两个是圆的,一个是长方的。两个圆形的,分别是激发光滤光片和发射光滤光片,那个长方的就是最重要的二分镜。

之所以说二分镜最重要,是因为将激发光/漫散射光和荧光发射光区分开就是二分镜的功劳。

激发光滤光片负责筛选合适激发光波长。比如将白光激发光筛选为蓝光,用于激发GFP等荧光素。如果用的是单波长的LED或者激光,激发光滤光片就不是必须的了。

发射光滤光片负责筛选需要的荧光发射光。当一个波长的激发光,能够激发不同发射光时,这个滤光片就可以将不同的发射光区分,比如同样可以用蓝光激发的FITC和PE。另外,因为很多生物学组织都有自发荧光,且自发荧光多处于红光区域,利用发射光滤光片可以过滤掉自发荧光干扰。如果一个样本只有一种荧光,而且没有自发荧光干扰,这个滤光片也是可以省略的。

二分镜作用是区分激发光和发射光,这个应该是必须的了。(事实上,这个也是可选的啊,不过这个不是本文的讨论的重点,这里就不给大家添乱了。)
绝大多数光路设计,采用的是二分镜,搭建方便,调节也方便。

那么问题来了,我们应该如何去选择适合我们实验的滤光片呢?
首先,我们需要确定我们所使用荧光素的激发和发射光谱。我们可以通过几个常用的网站,查询荧光素的光谱。比如Thermo旗下的Invitrogen/Molecular Probe网站,有比较好用的荧光光谱查看器,如果是一些流式细胞分析用荧光素,可能需要到对应的公司网站查询。滤光片厂家如Chroma也可以查询很多的荧光素光谱。





得到荧光光谱信息后,我们就可以针对性的查询所需的滤光片了。




我们可以将滤光片光谱与荧光素光谱重叠在一起,分析滤光片是否合适。




当然,在选择滤光片时,还需要考虑激光光源的光谱,特别是汞灯、金属卤素灯和白光LED,避免选择光源发射较弱的区域。

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