LAS X功能冰山一角之FRET成像

2018-10-12 10:53:02 普赫 3109


随着显微成像技术的发展,科研工作者对成像分辨率的要求越来越高,为此Leica在最新一代SP8共聚焦显微镜的基础上相继推出了超高分辨的STED和高分辨的Hyvolution;另一方面,简单的图像采集和分辨率的提升已经不能满足很多科研工作者的需求,他们需要更高级更强大的成像功能与图像处理功能。

LAS X软件作为Leica显微成像的搭载平台,不仅能够提供完美的成像质量,而且整合了众多高级应用并具有强大的后期数据处理分析功能,包括图像2D、3D测量与分析功能、FRAP功能、FRET功能、Hyvolution高分辨功能、活细胞记录分析功能(live data mode)等,可根据用户不同的需求提供灵活的成像方案。

接下来小编将以FRET为例介绍其在生物医药领域中的应用。

图1 LAS X软件强大的图像后期处理及高级成像模块。


FRET 简介

FRET(Förster resonance energy transfer,荧光共振能量转移)发生在供体荧光分子与受体荧光分子的距离足够近且供体的发射光谱与受体的吸收光谱相重叠时(10 nm以内)。当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态,在该电子回到基态前,通过共振实现能量向邻近受体分子转移。发生FRET后,供体的荧光强度比它单独存在时要低的多,而受体发射的荧光却大大增强,同时供体的荧光寿命也会因FRET的发生而缩短(FLIM-FRET应用)。

因此通过FRET可以分别从荧光强度及荧光寿命两个维度检测分子间的相互作用及分子的折叠与构象变化。

2 FRET发生原理。


FRET 在生物医药领域中的应用

1)2016年发表在nature communication上的文章“AFRET biosensor reveals spatiotemporal activation and functions of aurora kinaseA in living cells”通过FRET技术构建了一种新型的生物敏感器(biosensor),通过该敏感器可以实现在活细胞内对Aurora kinase A蛋白时空调控及功能的研究。

首先,作者分别在体外和体内借助FLIM-FRET及免疫印迹技术证明生物敏感器GFP-AURKA-mCherry能够正确的反映Aurora kinase A的激活情况,且其发生FRET的条件即其构象的改变是由其Thr288发生磷酸化导致的。通过定位及功能回复实验,作者进一步证明该生物敏感器能正确行使Aurora kinaseA的功能。

3 在体外通过FLIM-FRET技术验证GFP-AURKA-mCherry生物传感器。


接下来通过该生物敏感器,作者成功实现了在活细胞内对Aurora kinaseA时空激活调控的观察,证明其在G1时期被激活,并通过TPX2和CEP192蛋白协同调节微管的稳定性。

4 TPX2CEP192G1时期激活GFP-AURKA-mCherry


Aurora kinase A是公认的治疗癌症的药物作用靶点,由于其表达量低,在活细胞内对其进行跟踪研究非常困难。该生物敏感器基于FRET技术构建,通过FLIM-FRET技术可成功实现在低表达量的条件下对Aurora kinase A展开研究,因此该生物敏感器对于针对Aurora kinase A的信号通路研究及癌症药物筛选具有重要意义。

2)另一篇发表在oncotarget上的文章“HER2-HER3 dimer quantification by FLIM-FRET predicts breast cancer metastaticrelapse independently of HER2 IHC status”利用了FLIM-FRET技术检测乳腺癌病人中HER2-HER3二聚体的水平。HER2表达水平升高是乳腺癌诊断中的一个重要指标,然而并不能用来检测仅由HER2-HER3二聚体升高引起的乳腺癌,因此急需新的检测方法。本文章基于FLIM-FRET技术顺利实现了对HER2-HER3二聚体水平的检测,因而成为检测由HER2-HER3升高引起的乳腺癌的一个新型诊断方法,对乳腺癌发生及愈后诊断具有重要意义。

5 通过FLIM-FRET技术检测HER2-HER3二聚体水平。


小结

LAS X软件中提供了专门的FRET技术操作向导,可分别通过FRET-AB(acceptor photo-bleaching)和FRET-SE(sensitizedemission)两种方法对样本进行检测,用户只需根据操作向导一步步操作就可轻松得到样本的FRET数据。

6 LAS X软件中的FRET操作向导。


对于其他高级成像模式,如FRAP、Hyvolution等,用户同样可根据相应操作向导快速实现数据的采集。结合LAS X强大的图像后期处理及分析功能,便可轻松获得可靠的数据。

 

参考文献:

1. Giulia Bertolin et.al., A FRET biosensor revealsspatiotemporal activation and functions of aurora kinase A in living cells,Nature Communications, 2016 Sep.

 2. Gregory Weitsman et.al., HER2-HER3dimer quantification by FLIM-FRET predicts breast cancer metastatic relapseindependently of HER2 IHC status, oncotarget, 2016 July.




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