超分辨率显微镜

2018-08-17 16:54:08 普赫 1017


仰望夜空,群星璀璨,夜幕浩瀚。科学的进步给予了我们这颗蓝色星球重新定位——地球只是茫茫沧海中小小一粟:太阳系不起眼的一员,银河系渺渺然一粒,星云团几近于无的一藐存在。当我们了解的越多,就会越好奇,宇宙究竟是何种模样。它初时的面貌,在没有时间的尽头,“Big bang”之后一切如何衍生与发展,暗物质以及暗能量又以怎样的姿势充斥其中。

2017引力波的发现验证了百年之前爱因斯坦广义相对论的正确性——恒星坍缩最终形成黑洞。黑洞,连光都休想逃逸的地方,百年之前还只是几页白纸上的短短方程式,百年之后,却端然存在于时空一隅。我们发现的越多,越会意识到我们知之甚少,但幸运的是,仁慈的上帝与我们分享了神奇的想象力。大尺度下的浩瀚宇宙让我们困惑又着迷,那么2017年的微观世界又与我们分享了哪些奥秘?

今年的诺贝尔生理学奖停留在了劳模生物果蝇身上,节律基因period的发现从分子水平诠释了“日出而作,日落而息”的典范生活也是全靠基因和蛋白调控的。PERperiod 基因编码的产物,PER在夜晚累积,白天分解,其浓度会在24h循环震荡,正是PER孜孜不倦,恪尽职守的工作,才让一个个小果蝇在生物钟的调控下健康长大。诸如PER这种纳米级别的小分子,是被哪个蛋白运载进入细胞核,又是怎样抑制其目的基因的转录,从而实现精准的自我反馈,这一系列复杂的生物学现象单靠普通光学显微镜是难以观测到的。正如引力波需要功能强大的“LlGO”才能捕捉, PER同样拥有自己的骑士鞍前马后。这便是现如今炙手可热的超分辨率显微镜。

尼康N-SIM 结构照明显微镜

普通光学显微镜下我们看酵母像一只只吃撑了胀肚的草履虫,看大片大片的放线菌像一汪草的海洋。很美,却是一种大尺度下的外在美。普通光学显微镜由于是宽场成像,会受到阿贝衍射极限(公式如下)的限制,最大分辨率是200nm. 然而现代生物学早已从表观走向机理,从细胞走向亚结构,无论是风靡一时的基因治疗还是备受瞩目的精准医疗都要求有更高分辨率的显微镜协助前行。这时超分辨率显微镜就应运而生了——尼康SIMSTORM.

100X油镜下的酵母菌

100X油镜下的放线菌

SIM (结构照明显微技术,由已故Mats Gustafsson 教授2000年发明)SIM是一种脑洞大开的设计。在了解其深奥艰涩的原理之前,我们先看一看“砸出万有引力的这只苹果”——莫尔纹。我们都有这样的体验,拿着手机对着电脑屏幕拍,拍出的图案总会出现很奇怪的条纹,拍摄角度不同,条纹也会随之改变,这便是“莫尔纹”。莫尔纹是摄影爱好者的梦魇。手机拍显示屏能够成像如此显著的莫尔纹,主要是因为手机成像芯片的晶格和显示器的晶格相似,拍摄的过程,也是晶格相互重叠的过程,这便造就了莫尔纹。SIM通过光栅,用高频率激光干涉照明细胞亚结构比如细胞骨架肌动蛋白丝,二者产生莫尔条纹,然后对多个相位和方向进行捕捉,通过复杂的傅里叶变换以及其他影像处理技术,便可复原出物镜肌动蛋白丝的模样,产生分辨率是普通显微镜2倍的影像。在传统SIM的基础上,最近又衍生出high NA SIM, leaky TIRF-SIM,PA NL-SIM等各具特色的SIM产品。相比PALMSTED, SIM成像速度很快,适用于各种荧光染料,可以长时间成像而不至于伤害活细胞样品。

SIM中“砸出万有引力的这只苹果”——莫尔纹

如果SIM是别开生面的设计,那么STORM (随机光学重构显微术) 便是对衍射极限堂而皇之的挑战。

显微镜的衍射极限指的是其可以分辨出两发光点的最小距离,距离越小,显微镜的分辨能力也就越好。那么,干嘛非要两光点同时发光呢,A亮时,B不发光,而B亮时,A不发光,再将两张图片重叠在一其,不就可以避免二者都发光时彼此干扰的局面了嘛! STORM便是从这样最简单原始的机理出发,使样品中每次仅有少量随机离散的单个荧光分子发光,通过高斯拟合,找出每个荧光分子中心点的坐标。重复拍摄多张图片之后,把所有荧光分子的中心点位置叠加形成整幅图像。STORM显微镜具有高于普通光学显微镜10倍以上的超高分辨率,该技术由庄小威教授2006年发明。 

相信不久的将来,会有越来越多新颖的思想和技术涌入超分辨一族。

庄小威教授和N-STORM

我们总会惊叹于科学大师们别具一格的思维方式,就仿佛那是来自于上帝的灵感。但他们数十年如一日孜孜不倦于此,调和着生活的柴米油盐,习惯着科研的酸甜苦辣,付出心血,抛洒智慧,成功背后往往隐藏着数不尽的磨难,向这群可爱而执着的人致敬!

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