荧光蛋白的介绍和光谱特性

2018-08-17 16:52:55 普赫 806


随着20 世纪 50 年代荧光蛋白的发现,荧光显微镜技术的发展前景发生了巨大的变化,而这一切均源于OsamoShimomura,他首次在维多利亚多管发光水母中发现了绿色荧光蛋白 (GFP)。后来,研究人员又发现了数百种 GFP 突变体,荧光蛋白也涵盖了从蓝色到红色光谱的广泛范围。随后,研究人员在珊瑚虫纲等其他物种中发现了更多荧光蛋白,甚至将发射波长延伸到了远红外区域。这就为科学家们寻找符合自身要求的理想荧光蛋白标签提供了广泛的可能性。本文概述了荧光蛋白领域的最新变化,还提供了一张排列清晰的表格,囊括了所有相关荧光蛋白的光谱特性。


维多利亚多管发光水母(A.victoria)中的荧光蛋白

GFP 或其变体的光谱特性在于构成发色团(图 1)的氨基酸结构。它们通常是在第 65–67 位上的三个氨基酸,或着是靠近该位置的氨基酸残基(例如,YFP)。除了关于发色团的主要突变以外,科学家还对其他基因位点定点诱变,以改善它们在异源性细胞系中的一些性能,包括蛋白的成熟和表达等其他因素(在生理温度下对密码子的选择以及蛋白质折叠等)。有一点需要注意的是,维多利亚多管发光水母是相对原始的海洋生物,它是没有体热系统的。

图 1:GFP的分子结构

即使因亮度和高光稳定性而成为最普遍荧光蛋白之一的 GFP,亦存在两大缺点:对 pH 具有一定的敏感性,以及存在二聚化的轻微倾向性。二聚作用或寡聚化是很多荧光蛋白都会发生的问题之一。这些荧光蛋白偏向于彼此积聚,这种积聚现象会导致出现伪影或对融合蛋白的位置和功能发生误释的情况。但科学家们也针对上述问题提供了解决方案。通过氨基酸关键位置的突变(F223R、L221K和 A206K),即亲水氨基酸替代非极性氨基酸,可以减少二聚化现象。所有可以使光谱得到改善以及具有实用性的遗传变化均以“增强型” FP 予以命名。

例如,wtGFP 经过增强变成了 EGFP(增强型 GFP),在波长为 488 nm处有单个激发峰,替代了原先在395 nm 和 475 nm处的复合吸收光谱。RogerTsien 等人发现的 wtGFP 首个突变型(S65T 突变型)比原始 wtGFP 要亮五倍,蛋白成熟时间也更短。而另一突变体 (F64L),其在 37°C下的蛋白成熟效率更高,这在人们观察活细胞中发挥了重要作用。

Sapphire 是一个受到广泛关注的 GFP 突变体,它表现出最大的斯托克斯位移(Stokes shift)。接近发色团位置上的突变区域(T203I)使其激发峰和发射峰分别变成了 399 nm 和 511 nm。Sapphire 表现出 112 nm 的斯托克斯位移。Emerald 是另一种 GFP 修饰,其光稳定性和亮度都经过了改善,且它在哺乳类细胞中可以更高效地进行蛋白折叠。

所有绿色荧光蛋白的亮度均相对较高,与此相反,在微观应用领域中,蓝色荧光蛋白的发射光强通常会降低。尽管如此,它们还是因为其他光谱属性而应用于光学检测领域。EBFP(增强型蓝色荧光蛋白)是经过几轮 wtGFP 突变而形成的。第一个突变体(Y66H)发射峰跳过绿色直接到蓝色光谱,而随后的突变体则产生最大激发和发射波长分别为 380 nm 和 448 nm 。这些光谱属性令其成为EGFP 在 FRET 显微镜中的“搭档”。最新发现的蓝色荧光蛋白包括Azurite、SBFP2 以及 EBFP2,这些荧光蛋白具有更高和更好的量子产率和光稳定性。目前,Sirius 是一款接替 EBFP 且拥有广阔前景的荧光蛋白,这种蛋白因其对 pH 的高耐受力(pH 3 -9 范围内均能保持稳定)而被广泛应用,此外,它还是迄今为止人们所发现的发射波长最短的荧光蛋白。

第二个“蓝色”系列的GFP突 变体是由蓝绿色荧光蛋白构成的—CFP。用色氨酸代替酪氨酸 (Y66W) 和进一步遗传变异,使荧光染料的亮度和光稳定性得以改善。这种ECFP 具有激发和发射双峰光谱,分别位于 433/445 nm 和 475/503 nm处,其亮度仅为 EGFP 的 40% 左右。Cerulean是著名的ECFP突变体,其具有较高的消光系数和量子产率,在亮度方面,它比 ECFP 高出 1.5 倍,并与 YFP 一起被用于FRET 之中。

GFP 突变体并不能直接改变发色团中三种主要氨基酸中的其中一种,因而导致黄色荧光蛋白增多。YFP 主要是由于蛋白 203 位的常见苏氨酸变为酪氨酸 (T203Y)。该氨基酸是 β桶的一部分,靠近发色团。相比 GFP,YFP激发和发射波长均变大,最大激发和发射波长分别为 514 nm 和 527 nm (EYFP)。EYFP 的其中一个特性就是它较高的 pH 敏感度。pH 为 6.5 时,EYFP 仅产生 50% 荧光,该特性并不总是缺点。对水疱、核内体等进行 pH 值检测时,EYFP 可以作为一项检测指标。有趣的是,该荧光的进一步突变 (Q69M) 会获得更好的耐酸性,并极大的提高了亮度(其亮度比 EGFP 高出 75%)。Citrine是一种光稳定性比 EGFP 要差的蛋白。另外一种 YFP 突变体 (F46L) 的蛋白成熟速度显著提高,且耐酸碱性得以改善,这种蛋白被称为Venus,是一种天蓝色 FRET 受体。


珊瑚虫荧光蛋白

正如我们在第一部分所了解的,维多利亚多管发光水母中的大多数荧光蛋白发射光的范围为蓝色至黄色光谱,但红色荧光蛋白缺失。俄罗斯科学家 Sergey A. Lukyanov 在珊瑚虫类中发现荧光蛋白后,弥补了上述缺陷。由于红色光谱中的细胞自发荧光少很多,因此,相比其他荧光蛋白而言,红色荧光蛋白有着较大优势。此外,这些红色荧光蛋白受到波长较长的光的激发,这对于活细胞是有利的,相比之下,波长较短的光会对样本造成损伤。相比水母蛋白,珊瑚类动物蛋白还有一项普遍存在的优势:在37°C 温度条件下,能够实现高效成熟。但维多利亚多管发光水母 GFP 及其衍生物必须经过基因修饰,并且需要以正确的方式进行蛋白质折叠才可得到成熟的蛋白,而珊瑚虫类蛋白无需分子设计即可成熟。这可能得益于它们群落生境中较为温暖的水温环境。 

DsRed 是人们在珊瑚虫中发现的首个荧光蛋白,而且它也是目前最常用的荧光蛋白之一。这种荧光蛋白的名称来源于海葵(Discosoma striata)。DsRed 的最大激发和发射波长分别为558 nm 和 583 nm。但当这种荧光蛋白的结构信息发布以后,首次发现所带来的欣喜却无法继续维持了。因为人们发现 DsRed 蛋白的成熟速度要比水母荧光蛋白缓慢很多,而且中间还需经历发色团载物台。在该载物台,DsRed发射绿光,与其他荧光蛋白发生重叠。正如 GFP 部分所描述的,DsRed 还存在一个问题:红色荧光海葵蛋白是专性四聚体,并易于形成寡聚体,这会导致融合蛋白的位置和功能发生误释。一般来说,珊瑚虫荧光蛋白与多管水母荧光蛋白的结构相似,发色团隐藏在β桶结构内,大小为 4 nm x 3 nm(高 x 直径)。而珊瑚虫类 β桶更显椭圆状,这就是二者的差异所在(图 2)。


图 2:DsRed 的分子结构

GFP “进化”的同时,研究人员开始修饰原始 DsRed,以克服它的结构缺陷。第二代DsRed,即DsRed2,经过突变改造后,荧光蛋白的寡聚物形成趋势减弱,蛋白成熟速度加快,并最大程度的减少了发射绿光的中间载物台。之后进一步诱变将产生红色荧光蛋白,而这种荧光蛋白完全抛弃了四聚体状态,但会以牺牲部分量子产率(DsRed2的 25%)为代价。Tsien 等人首次研究出了单体红色荧光蛋白,这种荧光蛋白被称为 mRFP1。

mRFP1 随即成为构造六种单体荧光蛋白的起点,其被称为 "mFruit"。这些荧光蛋白的名称都是按照它们发射光线的颜色来命名的:mHoneydew、mBanana、mOrange、mTangerine、mStrawberry和 mCherry。mCherry是这些荧光蛋白中最为实用的,发射光在 610 nm 范围内,亮度为 EGFP 的50%。

到目前为止,最亮的荧光蛋白是 mFruit 系列的后续产物,其被称为 tdTomato。经过基因改造后,dTomato 成为一种专性二聚体,但将两个二聚体放进同一个分子后,就能够避免产生二聚作用。两个 dTomato 单位是通过12 个氨基酸组成的短链相连接,构成串联二聚体荧光蛋白tdTomato,这种荧光蛋白的最大发射波长为 581 nm,并在最高区域拥有良好的光稳定性。

当另一种 mFruit 后续蛋白产生后,发射光谱将进一步移至远红外区域 (630 nm –700 nm)。mPlum 属于 mFruit 系列的一种,它比任何mFruit 蛋白的发射波长都要深远,在红外区的649 nm处。

能够为科研所利用的绿色荧光珊瑚虫蛋白的数量是非常少的,但鉴于众所周知且被广泛使用的维多利亚多管发光水母GFP ,这一点就不足为奇了。显然,人们并未发现构建新型绿色荧光蛋白的必要性。虽然如此,也还是有一些的,比如,来自石珊瑚 Galaxeidae的明亮荧光蛋白,被称为 Azami Green。有趣的是,它与EGFP 的同源序列低于 6%。

此外,还有一种珊瑚虫蛋白会对深层组织成像产生重大影响,即Katushka。它是通过奶嘴海葵RFP 的进一步突变,产生了一种二聚体蛋白,人们将其命名为 Katushka,其最大发射波长为 635 nm,并且是所有深红色荧光蛋白区亮度最强的荧光蛋白。Katushka的单体形式为mKate,它提供的亮度更强,因而产生了mKate2。

综上所述,如今用于显微镜应用领域的所有荧光蛋白都是从原始的海洋生物衍生而来的。表 1 涵盖了一些最重要的荧光蛋白及其相关的光谱特性,例如,最大激发和发射波长、光稳定性、量子产率和亮度。


前景展望

一个相当有趣的发现是:有一种FP 是通过脊椎动物予以表达的。文昌鱼是一种类似鱼的海洋脊索动物,它身体的侧前壁会产生AmphiGFP。对这个荧光蛋白的序列分析可以预测到典型的β-桶状结构,且似乎与桡足动物Pontellina plumata(甲壳纲动物)的CopGFP具有相关性。这项发现表明了荧光现象并不受限于原始的无脊椎动物,在一些高等动物中也会存在荧光现象。此外,这项发现还显示了荧光蛋白发现、处理和完善的持续过程,如今这仍是研究人员探讨的热点课题。这一事实证实了荧光蛋白在最近和将来生命科学研究中的重要意义和深远影响。


荧光蛋白的光谱特性


表 1:荧光蛋白,资料来源:http://flowcyt.salk.edu/fluo.html

Ex:激发光波长(nm)
Em:发射光波长 (nm)
MW:分子量
QY:量子产率
BR:亮度;消光系数 * 量子产率/1,000
PS:光稳定性;亮度达到 50% 所需的时间(秒)


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