关于荧光显微镜你应该知道的

2019-02-22 10:24:54 普赫 953

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图片由尼康DS-Ri2显微摄像头拍摄-点击了解更多

在诸多显微镜的观察模式中,明场成像得到的是光强度最直接的变化,相差成像等技术也大多是将光的相位差等转变为强度差,使人眼能够感受到。荧光成像技术则是特异性地区分出光的波长,也就是光的颜色,使人眼能够区分。

光被人眼所看到分为两种形式:发光和反光。明场成像属于反光形式,荧光则属于发光形式。

物体获得能量后可能产生发光现象,能量来源可能是热能(如白炽灯),化学能(如萤光)或者核能(如阳光),而荧光的能量来源则是另一束能量更高的光。

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高能量的光子与电子碰撞,使得电子从基态跃迁到激发态。激发态的电子很不稳定,会重新回落到基态,这个过程中会消耗部分热能,并发出新的光子。新的光子能量比最初的光子能量低,因此波长更长。由于新的光子波长区别于入射光的光子波长,通过一定的光学处理方法将两束不同波长的光分开,从而使我们只看到发射出来的新光子(荧光信号),也就是荧光显微镜看到的荧光图像。

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具有荧光特性的物质叫荧光素,不同的荧光素对不同波长的入射光激发效率不同,这种差异体现在荧光素的激发光谱上。同样的,不同荧光素发射出的新光子波长也不同,这种差异体现在荧光素的发射光谱上。因此,了解一种荧光素的实验方法,主要是了解其激发和发射光谱,其中发射光谱是荧光素的特征光谱。

实现入射光与发射光分离的部分是荧光显微镜的核心,通常采用三片滤光片结构。

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以白光作为激发光源时,利用第一块激发光滤光片将白光过滤,使荧光素对应的最适激发波长的光透过。二向色镜是这个结构的核心,它负责将入射光与发射荧光分开,使入射光反射进入物镜,照射到样本上,样本中的荧光素便被激发产生荧光,发射出来的荧光被物镜收集后,穿过二向色镜。荧光再通过发射光滤光片,选择具有特征性的发射光范围,最终进入目镜或者成像设备中。

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图片示例图为奥林巴斯IX73倒置荧光显微镜-点击了解产品详情

以上的结构是常见的荧光显微镜成像光路,也被称作反射荧光光路。

荧光照明的光源有很多种,理论上普通的白光光源也可以,但是实际上因为荧光的激发效率很低,因此需要亮度足够的光源。目前常用的荧光光源有4种:

汞灯:汞蒸气激发光源,传统荧光光源。
氙灯:氙弧光灯,光谱连续且强度平均。
激光:单色性好,强度高。
LED:寿命长,单色性较好,亮度高,是今后光源的主要发展方向。

荧光成像的优势:

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以上图像由Dhyana400DC 科学级CMOS彩色相机拍摄

通过二向色镜将入射光和荧光区分开,使我们只看到荧光信号,没有其他光线的干扰,因此可以看到很微弱的信号,比如单分子荧光。

因为荧光素可以特异性地标记到不同的细胞或分子上,因此可以区分不同的细胞或分子。

不同强度的荧光可以进行比较,从而实现细胞或分子的定量分析。

目前更高端的显微镜系统,如共聚焦显微镜、双光子显微镜、超高分辨率显微镜、光切片显微镜等都是利用荧光成像方法进行观察和分析的。

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