尼康共聚焦显微镜-基础知识

2019-09-02 16:01:56 普赫 359

AOTFAcousto-optical tunable filter

AOTF即所谓的声光调制滤光片。通过施加在AOTF上的射频信号,可以选择激光的波长,调节激光的强度。在A1 confocal中,激光器通过AOTF之后进入共聚焦扫描头。

当我们在NIS-Elements件中选择激光波长和调节激光强度时,就是通过AOTF来实现的


Binary

Binary即二值化蒙板。在NIS-Elements里面Binary是用来圈定测量范围的一个工具

举例来说,我们有如下图像:

通过Threshold工具,我们可以指定一个强度范围(715-4746),所有强度在这个范围之内的像素会被选中,生成一个Binary图层(像素值只有01两种数值。0对应的像素不被选中,1对应的像素被选中)。

就像把一张黑纸蒙在原图上,然后在黑纸上挖出一些洞(白色部分),把需要测量的部分露出来。

这样,原图叠加上Binary图层,显示如下:

Binary图层是进行自动测量的基础。

NIS-Elements中,我们还可以通过Binary Layers工具,对多个Binary进行操作,得到其交集,并集等新的Binary


Bit Depth

数字图像是由一个个的像素(Pixel)组成的。每个Pixel对应一个灰度值(grayscale),也就是NIS-Elements软件中的强度值(Intensity)。

Bit Depth指的是用几个bit来记录pixelIntensity

如果Bit Depth=1,用1bit来记录Intensity,那么Intensity只能有两种状态(21次方):要么是0,要么是1

如果Bit Depth=2,用2bit来记录Intensity,则Intensity能有4种状态(22次方):000),101),210);311);

同理,当Bit Depth=8时,Intensity能有25628次方)种状态,从0255

Bit Depth越高,就意味着图像可以记录更丰富的灰度层次,灰度更加细腻,精确。

A1拍摄的图像Bit Depth=12,对应的Intensity4096212次方)级,从04095

 

NIS-Elements的图像窗口右下方信息栏中,我们可以看到当前图像的Bit Depth以及光标处像素的Intensity

注意:在Windows以及WordPowerPoint等软件中,支持8bit的图像。所以,如果我们想在windows下直接打开或者在Word等应用程序中插入图像时,需要把12bit的图像转化为8bit


Cross Talk荧光串色

在进行多通道拍摄时,容易出现荧光串色的现象。

比如,拍摄FITC(绿色)+TxRed(红色)时,

如果同时打开488nm激光和561nm激光,同时拍摄绿色和红色荧光时,FITC的荧光有可能会串到红色通道,对红色通道造成干扰。如下图:

解决方法:

采用Ch Series模式,每次只拍摄一个通道,顺次拍摄。

具体的说,就是:先只打开488nm激光,拍摄绿色通道;然后只打开561nm激光,只拍摄红色通道。

这样就能有效减少荧光的串色现象。


HVHigh Voltage 

A1 confocal中,用来记录荧光强度的设备是PMTPhotoMultiplier Tube,光电倍增管)。

当荧光分子撞击到PMT靶面后,会转化为光子,光子数经过多级电极之间的放大后输出,再经过特定的转换电路,成为图像中pixel对应的Intensity数值。

当增大PMT的电压HV时,PMT输出的光子数更多,会得到更亮的图像。

但是HV增大会导致图像中噪声的增加。

因此在拍摄时我们要根据标本的实际情况选择合适的HV

相关信息可以参照“S/N信噪比”词条。


LUTLook-up Table

NIS-Elements软件中,LUT是一种用来调节图像亮度和对比度的方式。

移动左侧黑色三角对应的竖线,通常用来消除背景荧光;

移动右侧白色三角对应的竖线,通常用来增强物镜荧光;

移动斜线上的菱形块,可以改变Gamma值(改变图像对比度的一种方法)。

注意:调节LUT时改变的只是图像的显示效果,并不会改变图像的原始数据,因此是安全的。另外,LUT相关的功能按钮也集成在NIS-Elements的图像窗口,随时可以进行LUT操作(包括在拍摄预览的时候)。


ND拍摄(N Dimensions

NIS-Elements可以很方便的进行多达6个维度的拍摄。

这些维度包括:

XY   :一个平面图像;

Z     :空间立体扫描;

T     :时间维度。记录标本的动态变化;

    :波长维度。拍摄多通道图像(注意:这个维度主要用于CCD成像,A1 confocal通常不需要);

M    :多视野。可以事先定义好多个视野,同时拍摄这多个视野(注意:需要电动载物台


nd2文件 

nd2文件是NIS-Elements的标准格式。在一个nd2文件中可以同时记录多达6个维度的信息,在查看和分析图像时非常方便。

如下图所示,该nd2文件同时记录了XYT5个时间点),M20个视野)以及GFPDIC两个通道的信息。TM维度有各自对应的播放区。

除此之外,nd2文件还记录了拍摄时完整的设备信息。比如:定标信息,曝光时间,激光强度……

相关信息可以很方便的进行再现。在拍摄条件需要严格一致的情况下(比如对照实验),再现功能非常有用。


OCOptical Configuration

NIS-Elements软件中,可以把多个设备的特定状态组合起来,生成一个OC按钮。单击该按钮,就可以使仪器快速切换到所需要的状态。

 

比如:在目镜下观察GFP时,我们需要一系列动作。

1.  关掉透射光光源;

2.  把荧光滤色块转盘转到GFP(或B-2A等)位置;

3.  光路切换到目镜

4.  打开荧光光源的光闸。

各个部件状态到位之后,我们可以点击生成一个OC按钮,命名为“GFP”。以后只需要点击GFP这个OC按钮,系统就会自动切换到在目镜下观察GFP的状态。

简单来说,OC就是“一键切换”。

OC可以关联的设备包括:

  1. 相机(包括ConfocalMP等);

  2. 显微镜的各个电动部件;

  3. 物镜

此外,OC还是nd拍摄中Lambda模式的基础。


ROIRegion of Interest

NIS-Elements软件中,可以灵活地生成一系列ROI,用于下列操作:

  1. ROI内图像进行统计,测量;

  2. Binary结合,一起限定测量的区域;

  3. 可以指定为Background ROI,定义背景荧光的强度;

  4. 可以指定为Stimulation ROI,定义光刺激区域

  5. ……

ROI对应一个独立的图层,可以随时打开或者关闭该图层。

ROIBinary之间还可以相互进行转化。


S/N信噪比Signal to Noise Ratio

信噪比即仪器在采集信号时,信号强度和噪声强度的比率。比如用收音机收听广播时,如果出现“滋滋啦啦”的声音,则说明信噪比比较低。

具体到共聚焦图像上,可以理解为图像上随机出现的杂点的多少。

下面的例子中,左侧图像的信噪比就比较高。

A1 Confocal拍摄时,PMTHV设定过高,会出现噪点增加,信噪比下降的现象。因此,在拍摄时要选择合适的HV值。通常设在100左右。

此外,通过Average模式可以有效提高信噪比。




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