STED在活细胞动态成像中的应用

2018-08-17 16:54:08 普赫 498

在活细胞状态下进行内部精细结构的高分辨率观察,一直都是细胞生物的研究趋势。纵观市场上的各种超高分辨率技术,除STED之外的各类超高产品,大多是通过采集批量的原始图片,再经过后期计算来进行分辨率的提高,这一系列的过程不可避免地就会导致成像速度的低下和计算处理导致的假象。例如单分子定位技术需要使用特殊的荧光标记物和制样方法,成像速度慢,深度浅,无法用于活细胞成像。而STED是目前唯一一种通过纯光学方式实现超高分辨率成像的技术,也是目前唯一一种比较适合用于活细胞成像的超高技术。



与需要使用特殊荧光标记的单分子定位超高技术不同,STED可使用常规的荧光染料和荧光蛋白(表1)进行超高成像。例如您为共聚焦成像制备的GFP、YFP等荧光蛋白标记的活细胞样品,无需其他额外的操作,即可用于STED成像。得益于分辨率的提高,STED可以对一些微小的细胞器结构进行单颗粒的动态轨迹追踪(图1)。



表1、适用于STED活细胞成像的荧光蛋白和标记物

图1、活体果蝇幼虫神经轴突中GFP标记的致密核心囊泡的运动轨迹

上图为confocal静态图像,中间图为STED静态图像,下图为根据STED动态图像数据,描绘出的囊泡运动轨迹,拍摄时间间隔为350ms。

SiR (Silicon-rhodamine)是一种亮度很强的红外染料,激发峰和发射峰分别为650nm和670nm,在这一光谱范围内细胞内的自发荧光也较少。更长的波长,也意味着更低的光毒性以及更强的成像穿透能力。SiR染料还有其他两个很重要的特点。一是SiR染料具有细胞膜渗透性,无需繁琐的转染操作,即可对活细胞进行荧光标记;二是与某些特定物质结合后,SiR染料会从非荧光的OFF状态转为发出强烈荧光的ON状态(图2A)。因此,通过巧妙的设计,携带SiR染料的苄基鸟嘌呤衍生物(benzylguanine derivatives )可与SNAP-tag快速特异结合,非常适合用于活细胞内目的蛋白的动态成像。目前已有公司对SiR-tubulin、SiR-actin、SiR-SNAP等进行商品化生产(图2B)。通过SiR、ATTO590与Halo、SNAP等标签的特异结合,可实现对细胞内不同组分进行双色STED超高动态成像(图3-图5)[1]。



图2、可用于活细胞成像的SiR探针

SiR-SNAP 供应商New England Biolabs Inc.: www.neb.com

SiR-Actin和SiR-Tubulin供应商Spirochrome Ltd.: www.spirochrome.com


图3、STED对线粒体和内质网的活细胞动态成像


图4、STED对高尔基体的活细胞动态成像


图5、STED对活细胞质膜上的clathrin-coated pits (CCPs)的动态成像

共聚焦多光子已被广泛应用于神经生物学领域,但是对于神经元中很多处于衍射极限以下的精细结构,传统光学方法依然无法观察,经常需要借助电镜。对于神经生物学研究而言,在活体状态下才能观察到最真实的信息,因为只有在活体状态下,神经元之间的所有连接才是完整而且是具备生物学功能的。STED是搭载在共聚焦平台之上,因此拥有接近于共聚焦的成像穿透深度。已有科学家通过YFP标记,以67nm的分辨率对活体小鼠大脑皮层中树突棘上的精细结构进行了动态观察(图6)[2]。



图6、STED对活体状态下的YFP标记小鼠大脑神经元进行超高分辨率动态成像

STED可以使用常规的荧光蛋白和样品制备方法进行成像,同时拥有可与共聚焦媲美的成像速度和深度,这些特点使其成为活细胞和活体动态超高成像技术中的首选。

 

参考文献:

1. Berning S et al. Nanoscopy in a Living Mouse Brain. Science 335: 551 (2012)

2. Bottanelli F et al. Two-colour live-cell nanoscale imaging of intracellular targets. Nature Communications: 10778 (2015)


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