课堂 | Leica SP8 FALCON 使用技巧
荧光寿命测量步骤
SP8 FALCON 的荧光寿命成像 (FLIM) 功能内置在共聚焦操作软件 LAS X 里，只需点击 FLIM 即可激活 (见下图)。
接下来，我们只需三步就可以完成荧光寿命测量。本文中所用样品为雏菊 (Bellis Perennis) 花蕾。
1. 预览及调节参数
点击预览，系统同时显示荧光强度图、平均荧光寿命图和平均荧光寿命曲线，并以光子数直方图中的红线来提示光子数的理想上限 (见下图)，便于我们调节激光强度获得理想的光子数 (以接近但不*过红线为宜)。
2. 设置条件并采图
在采集时间、采集帧数及*大光子数三者中选择设置一项即可 (见下图)，如果需要采集时间序列或者三维，按常规共聚焦采集模式设置总时长或层切起点/终点即可。然后点击 start 进行采图。
3. 数据分析
选择寿命成分数量 (见下图一棕色箭头)，点击 Fit (图一红色箭头)，系统即自动进行曲线拟合。寿命成分数量可从 1 开始，直至获得满意的拟合曲线 (见图三)。同时，系统根据拟合结果显示荧光寿命图 (见图二)。
图一
图二
图三
到这里，图像和数据的采集及分析就完成了，点击保存图像和结果即可。
一键采图，一键拟合，so easy！
寿命成分拆分图像
当然，我们还可以根据拟合出的寿命成分对图像进行拆分，以上述分析结果为例，点击 FLIM Image Fit，系统自动按照拟合出的三种寿命进行拆分，得到以下图像。这特别适合于拆分光谱接近的不同染料或者染料和自发荧光。以后遇到多色荧光成像，再也不用担心串色和分不开了。
对厚样品，FALCON 还可以直接采集和显示三维的荧光寿命图像 (见下图)，要做成视频也完全没有问题，用 LAS X 的 3D 重建模块就可以。
SP8 FALCON 的功能还远不止于此，它还能进行任意感兴趣区域分析、FRET 分析、Pattern Match 分析，和 DIVE、STED 结合成像，以及近期刚刚增加的 Phasor 功能，为传统的荧光成像增加维度、拓宽思路。有兴趣的话，且听下回分解。