哪种传感器最适合共聚焦成像?

2019-02-22 10:25:05 Pooher Inc. 71

哪种传感器最适合共聚焦成像?

混合光电探测器(HyD)是!在这篇简短的文章中解释了为什么会出现这种情况。

生物学研究关注生命,因此,如果可能的话,应该用显微镜研究活体样品。荧光染色应尽可能稀疏,以尽量减少对生物功能和参数的任何潜在的操作影响。背景应该是漆黑(给定干净的样品)并且信号没有不必要的噪声。因此,共焦荧光成像需要高灵敏度和光子效率的设备。除了光学镜头和滤光片外,传感器在实现这一目标方面发挥着重要作用。迄今为止取得了良好的效果,其中有一些苔藓过度生长的真空技术,由PMT(光电倍增管)代表,以及更多现代半导体技术,以APD(雪崩光电二极管)为代表。

混合探测器(HyD)是这两种技术的嵌合体。它灵巧地结合了这两个概念,并保持了两者的有益特征:

l短脉冲和相等的脉冲

l噪音极低,而且

l动态范围大。

传感器类型

真正的共聚焦扫描显微镜将光线聚焦成一个点。为了生成二维图像,必须在样品上沿x和y方向扫描该斑点。尽管扫描机器在设计和制造方面需要一些努力,但是与宽视场相机芯片相比,传感器可以是单个设备,其必须提供与所请求的图像元素(像素)并行的尽可能多的传感器元件。由于不需要xy读出电子器件,与阵列检测器相比,单点传感器具有更好的信噪比。

光电倍增管(PMT)

到目前为止,最着名的共焦成像传感器可能是经典的PMT(图01),它在80年前的1930年代早期开始其职业生涯[ 1 ]。它基于光电效应,首先由H.赫兹[ 2 ] 描述并由A.爱因斯坦[ 3 ] 解释。光电子阴极,通常是在吸收光子时可以容易地释放电子的碱性原子层,暴露于辐射源(这里,光聚焦在光电阴极上)。使用砷化镓磷化物阴极(GaAsP)在可见光范围内实现量子效率方面的最佳性能)。电压将光电子加速到第一打拿极,其中二次电子被释放。由于倍增极材料的特性,倍增电极的增益通常限制在小于五倍。由单个打拿极产生的电脉冲不能与电噪声区分开。为了获得足够的增益,二次电子被加速到下一个打拿极等等[ 4 ]。该程序允许增益大约为10 8甚至更多,这足以获得可测量的电流。

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01:光电倍增管(PMT):光子(hν)撞击光电阴极,其中释放光电子(e-)。电极数(蓝点)在每个打拿极处倍增,最后的电子云在阳极读出。

光电倍增管具有非常宽的动态范围,即它们可用于非常低的光子密度和相对较高的强度。

雪崩光电二极管(APD)

真空PMT的半导体对应物通过发明APD而被推向市场,APD是PIN二极管的衍生物。PIN二极管在p型和n型层之间具有额外的稀疏掺杂层。该APD是一个改进的PIN二极管,辅以倍增层(图02)。如果光子在本征层中被吸收,它将产生电荷对(内部光电效应),然后通过施加的电压加速电荷。倍增区中的强电场(图02中的pn)通过释放许多(最多约1000个)附加电荷而引起放大。输出信号与吸收的光子数成比例,因此,该器件可以在一定强度范围内用作光传感器。在较高的电压下,光子的吸收会导致击穿并伴有非常高的增益(高达10 8,“盖革模式”),通常用于单光子探测。由于连续击穿会破坏器件,因此该模式仅适用于足够低的光强度。

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02:雪崩光电二极管(APD):固有(i)区域中光子的吸收导致电荷分离。电荷加速到乘法区(pn),在那里实现增益。

APD已成功用于单光子测量,特别是在FLIM(荧光寿命成像)和 FCS (荧光相关光谱)实验中。但是,它们很少用于共焦图像记录。

混合探测器(HyD,HPD)

PMT的主要限制是每个乘法步骤的低增益。的APD的主要限制是其范围的操作:只有非常低的强度(在盖革模式)。这两种技术的混合组合提供了一种解决方案,幸运的是它显示了两者的有益特征。这种真空和半导体技术的结合最初是为粒子物理实验而开发的[ 5 ]。

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03:混合检测器(HyD):光电子吸收光子(hν)释放光电子(e-)。光电子通过高电压加速并在碰撞到半导体靶中之后耗散其能量。通过倍增区(pn)再次放大电荷数,并且可以在阳极读出信号。

混合探测器使用光电阴极(如PMT)和GaAsP以获得最佳性能。光电子通过大约8000伏的高电压一步加速。高能光电子撞击半导体靶,其中动能被消散,并被转换成分离的电荷(电子 - 空穴对)。此步骤中的增益已经大约为1500.下面的乘法层(参见雪崩二极管)再次将信号提升约100倍。现在,在阳极处拾取可测量的信号就足够了。该信号是一系列电脉冲,其中每个脉冲与到达阴极的一个光子相关。

参数

尽管三类传感器都将光子转换为电信号,但它们的表现却截然不同。为了找出最适合共聚焦成像的传感器,我们将简要介绍三个重要参数:

l噪声,

l脉冲均匀性,和

l脉冲宽度。

如果我们想要使用光子计数而不是模拟积分,后两者是非常重要的6 ]。光子计数更精确,并提供像素信息与样本亮度的直接比率。

噪声

在各种噪声源中,暗噪声严重影响低强度图像的质量。在我们的上下文中的暗噪声表示阳极处的信号(电脉冲),而没有光子被阴极吸收。它基本上由敏感元件的温度及其尺寸决定。例如,如果温度足够高以引起偶尔从阴极材料释放电子,则光电阴极本身将在绝对黑暗中发射电子。通过施加的电压加速该电子并在阳极处产生看起来像光子脉冲的脉冲。此外,倍增电极可以发射热电子,其中第一倍增电极产生比更靠近阳极的倍增电极更高的脉冲。由此我们可以得出结论,来自打拿极的热电子只是与PMT有关的问题:APD没有打拿极。光电阴极和倍增电极的热电子发生的对应物是半导体材料的热电荷分离。整体暗噪声由来自所有可能贡献者的电子组成。如果需要非常低的暗噪声,传感器将受益于冷却:在将温度降低大约5 K时,暗噪声减半(取决于材料)。极低强度的应用甚至使用液氮冷却来基本上消除暗噪声。

阴极尺寸约为50 mm 2的经典PMT 加上额外的打拿极区域,具有相当高的暗噪声(见表01),这可防止它们用于光子密度非常低的应用中。对于实时样品实验,目标是尽可能使用昏暗的照明光,以免通过光毒性反应破坏样品。不幸的是,这个要求会增加噪音问题。APD和HyDs没有打拿极。对于这些设备,暗噪声主要由传感器的有效区域控制。APD的有效面积通常约为0.05 mm 2,即非常小,需要额外的手段和努力来将光稳定地聚焦到目标上。请记住:共焦显微镜不使用固定的扫描光束,而是使用扫描光束。除此之外,光学部件的多种选择以及对精确对准的需求也会增加。HyD的有效面积约为7 mm 2,小到足以抑制暗噪声[ 7 ] 并且足够大以确保即使在紧张的条件下也能完全拾取光信号。

脉冲高度分布

理想地,从阴极释放的任何光电子的输出脉冲看起来完全相同。虽然实际上,这个假设远非实际,特别是对于PMT,我们将在下面看到。脉冲宽度和光子吸收与输出脉冲峰值之间的时间(称为“传播时间”)不仅变化,而且脉冲的高度也变化。脉冲高度变化直接导致通过积分阳极电流记录的信号的变化(噪声)。在光子计数的情况下,如果不能将脉冲与放大电路的电子噪声区分开来,脉冲高度的变化可能导致计数损失(参见表01和图4,PMT情况下的事件#2等同于事件#3)在HyD案件中#4。

输出脉冲的高度基本上由第一个放大步骤8 ] 的增益决定。对于PMT,这是第一个打拿极的增益。如上所述,该增益受到倍增极电极材料的限制并且落在2到8的范围内。该变化由泊松统计量控制,例如,如果我们假设平均增益为4,则变化为+/- 2,这意味着在下一次事件中很有可能获得2到6个电子。然后脉冲高度变化大约三倍。后期倍增电极的增益具有相同的统计行为,但随着电子数量从打拿极增加到打拿极,这些变化被平均并且对噪声贡献较小。

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04:PMT信号和HyD信号(PMT虚线和HyD实线)的比较。由于峰值变化,HyD的计数#2在PMT情况下丢失。HyD的计数#3和#4由于宽的脉冲宽度而“熔化”在一起成为PMT的单个计数。

HyD中情况完全不同,其中第一步的增益为1500.增益的变化与其平方根(Poisson统计)成正比,因此,峰值变化变化小于3%,即100倍优于PMT案例。由于脉冲高度均匀,特别是使用HyD的光子计数更加精确。如前所述,光子计数是强度测量的金标准。

脉冲宽度

通过计算传感器输出端的脉冲来完成光子计数。更亮的强度与每次更多的脉冲相关。如果强度超过一定水平,则脉冲开始“融合”在一起并且各个事件不能分开(参见图04和表01)。该光强度水平显然与电脉冲的宽度强烈相关:脉冲越细,可用于成像的强度越高。通常用于共焦成像的PMT产生相当长的脉冲,在大约20ns的范围内。光强度是在给定像素中检测到的每单位时间的光子量。在光子计数模式中,强度被描述为“每秒计数”。如果光子以相同的间隔到达20 ns,一秒钟将持有5000万计数(每秒50兆位--50麦克风)。但光子以随机方式从样品中发射,因此最大允许脉冲仅为约15 Mcps。标准荧光样品在共聚焦体积中可提供约100 Mcps,因此在光子计数模式下使用PMT无法测量其信号。APD的动态范围受限,因为传感器在每次脉冲后需要很长的死区时间进行再生。在脉冲持续时间和死区时间内到达的光子会丢失。只有极低的强度才能用APD准确量化。因此,在光子计数模式下,PMT无法测量其信号。APD的动态范围受限,因为传感器在每次脉冲后需要很长的死区时间进行再生。在脉冲持续时间和死区时间内到达的光子会丢失。只有极低的强度才能用APD准确量化。因此,在光子计数模式下,PMT无法测量其信号。APD的动态范围受限,因为传感器在每次脉冲后需要很长的死区时间进行再生。在脉冲持续时间和死区时间内到达的光子会丢失。只有极低的强度才能用APD准确量化。

HyD显示大约1 ns的脉冲。带有HyD的SP8平台可以高达300 Mcps的速度运行,因此适用于标准荧光共聚焦成像。其动态范围涵盖非常低的光强度和用于共聚焦成像的标准荧光染色样品。

概要

与光电倍增管(PMT)相比,混合检测器(HyD)显示出非常低的噪声,如标签01的第一行所示。暗噪声电平与雪崩光电二极管(APD)相当。此外,脉冲非常均匀,这使它们成为光子计数的理想设备 - 类似于APD,如标签01的第二行所示.PMT和APD之间的区别是非常短的脉冲宽度,没有延迟时间(第三行)标签01)。这种差异允许HyDs用于检测通常在荧光样品中发现的强度,而APD在饱和后会很长。HyD产生清晰的荧光图像,具有真正的黑色背景,适用于低强度情况(如高速实时成像)和标准荧光样品。

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标签01:概述PMT,APD和HyD的最重要参数(用于共焦成像的单位的典型值 - 给定传感器的实际值可能显着不同)。

HyD配备有砷化镓 - 磷化物(GaAsP)阴极。HyD量子效率与GaAsP PMT 相同。尽管如此,由于光电子的短而直的轨迹,HyD光子探测效率甚至优于PMT。

顺便说一句,HyDs也是特殊应用的理想传感器,如荧光寿命成像(FLIM)和荧光相关光谱(FCS),因为它们显示非常窄的传输时间变化,并且基本上没有脉冲后。这使得HyD成为任何基于光束扫描的显微镜传感器的冠军


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