奥林巴斯显微镜荧光滤光片

2019-09-02 16:01:56 Pooher Inc. 335

应用于荧光滤光片的术语由于不同制造商使用各种缩写来识别滤光片而变得混乱。在这个讨论中,我们试图对这个混淆的术语做出一些排序。基本上有三种类型的滤光片可供选择:激励滤光片,屏障滤光片和二色分光镜(二向色镜),通常将这些滤光片组合起来以产生类似于图1所示滤光片的滤光片。正确选择滤光片是成功的荧光显微镜

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激发滤光片仅允许来自照明器的选定波长在通向样品的路上通过。屏障滤波器是设计用于抑制或阻挡(吸收)激发波长并仅允许选择的发射波长通过眼睛或其他检测器的滤波器。二色分光镜(二向色镜)是专门设计用于有效反射激发波长并传输发射波长的滤光片。它们用于反射光荧光照明器,并位于激励滤波器之后但屏障滤波器之前的光路中。如图1所示,双色分光镜与通过激发滤光片的光线成45度角,并与屏障滤光片呈45度角。

荧光滤光片以前几乎完全由夹在玻璃之间的彩色玻璃或彩色明胶制成。由于采用了更为复杂的滤波技术,已经开发了干涉滤波器,其由玻璃上的介电涂层(具有变化的折射率和反射率)组成。这些滤光片设计用于以高选择性和高透射率传递或抑制光的波长。今天的大多数激励滤波器都是干扰类型; 为了特殊需要,一些屏障过滤器也是干涉类型。双色分光镜是专用的干涉滤光片。有时将短通滤波器(SP)和长通(LP)滤波器组合起来以缩小通过这种组合的波长带。(图3(c))

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励磁滤波器 - 制造商用来表示其滤波器性能的缩写包括:UG(紫外线玻璃)和BG(蓝色玻璃),它们是玻璃激励滤波器。 KPK是kurz的缩写,德文简称),SP是短通滤波器; 和 EX指示的激励器过滤器。

今天,大多数励磁滤波器都是干扰类型的。如图2(a)所示,KPSP滤波器的透射曲线在曲线的右侧显示陡峭的下降。如果励磁滤波器标有字母BBP,则它是带通滤波器(图3)。甲BP滤波器是具有波长截止两者的左侧和其曲线的右侧的过滤器(参照图3(a)和3(b))。与这些滤波器相关的数字可能是指带通激励滤波器的最大传输波长。对于SPKP滤波器,该数字可以指最大传输的50%处的波长。对于带通滤波器,有时会说明在50%的最大传输水平下的纳米带宽。带通滤波器被设计为仅通过波长谱的期望波段; 许多干涉带通滤波器通过一个窄谱带。一些制造商标记其干涉滤波器的名称为IF。如果斯托克斯位移很小,窄带干涉带通滤波器特别有用。

屏障过滤器 - 屏障过滤器的缩略语或缩写包括:LPL用于长通滤光片,YGG用于黄色或gelb(德国)玻璃,RRG用于红色玻璃,OGO用于橙色玻璃,K用于kante,a德语术语边缘(滤波器),BA 为屏障滤波器。

阻挡滤光片阻挡(抑制)较短的波长,并且对于较长的波长具有高透射率。当滤波器类型也与数字相关时,例如BA475,该指定是指在其最大传输的50%时的波长(纳米)。屏障滤波器的曲线通常在左侧显示出尖锐的边缘,表示波长位于该边缘的左侧(参见图2(b))。现代屏障滤波器通常是干扰类型,其中许多是透射曲线左侧和右侧带通锐截的带通,如下图3所示。

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二色性分束器 -使用的缩写来描述和识别的分束器是:CBS用于色分束器,DM为二向色镜,TK为“teiler坎特”,德国用于边缘分离器, FT 为“FARB teiler”,德国的彩色分离器,和RKP反射短传。所有这些术语都应该被认为是可以互换的。

这些滤波器始终是干扰类型。这些涂层被设计成对较短波长具有高反射率,对较长波长具有高透射率。二色分光镜的方向与通过反射光荧光照明器进入立方体的激发光路径成45度角。它们的功能是将选定的激发(较短波长)光通过物镜并照射到样品上。它们还具有将更长波长的光传递到屏障过滤器的附加功能,并将任何散射的激发光反射回灯箱的方向。

在许多当前的反射光荧光照明器中,激励滤波器,分色镜和屏障滤波器都被合并到如图1和6所示的单个立方体中。照明器借助滑动器或旋转装置可以包含多达三个或四个立方体,从而使用户可以方便地使用各种规格的荧光染料。为了优化某些荧光染料的激发或发射波长,可以容易地附加替代激发器和屏障。标准的激励滤波器和屏障滤波器是用户可拆卸的,因此定制的滤波器也可以安装到显微镜中。

通常,灯罩内装有红外线或热过滤器,以防止荧光过滤器受热劣化。某些照明器可能会加入或接受红色抑制滤镜(指定为BG38),以消除与某些滤镜组合相关的视场背景变红。而且,照明器可以接受中性密度滤光器和/或具有不透明的光快门以减少或暂时阻挡光到达样品。

建议您咨询制造商,了解他们在命名和识别其特定过滤器时使用的程序。我们的数据表中给出了Olympus荧光显微镜命名使用的样品,但您应该记住,制造商的命名规则有所不同。显微镜公司可以为其激发器和屏障滤光片以及它们的分色镜提供透射曲线。截至1998年7月,这些信息并未在主要制造商的网站上提供,但我们将在链接可用时提供。

蓝色激励的立方体 - 为了理解立方体的功能,让我们以蓝色激励的常用立方体为例。这个立方体(使用奥林巴斯U-URA照明器名称)是U-MWB立方体。该U形MWB立方体具有一个带通450-480激励器过滤器,如在图4(a)所示。该名称意味着高比例的激发光波长在450和480纳米之间。这个立方体中的分色镜是DM500,如此命名,因为500纳米是该镜面最大透射率的50%处的波长。该镜面的透射曲线显示500纳米以上的高透射率,500纳米左侧的透射率急剧下降,500纳米左侧的最大反射率,但仍可能在500纳米以下具有一些透射率。该立方体中的屏障滤波器是BA515,它具有515纳米以下的陡峭斜率,因此在515以下通过的光线很少。BA515是一种长通滤波器,可以将高于515的高波长从绿色传输到远红(图4(a))。

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如果您希望缩小蓝色激发的激发频带,可以选择U-MWIB立方体。该立方体具有干涉激发滤波器(在激励带两侧非常尖锐的斜率)BP460,二向色镜DM505和屏障长通515IF(干涉屏障滤波器)。如图4(b)所示,激发器和屏障滤波器的尖锐斜率在激发和发射波长分离方面做得更好,并具有最小的重叠。

如果您希望进行蓝色激发,但希望将发射的波长限制穿过屏障滤光片,仅限于绿色发射,则可以选择U-MWIBBP立方体。该立方体与U-MWIB立方体具有相同的激发器和分色镜,但作为其屏障滤波器,它具有带通BA515-550(不是长通滤波器)。这种屏障滤光片仅通过515-550nm之间的绿色波长的光,并阻挡550以上的更长波长,并阻挡短于515nm的波长(图5(a))。

还有其他用于蓝色激发的立方体,例如在我们的荧光立方体数据表中与其他U-URA立方体一起列出的U-MNIBU-MNIBBP立方体。如果没有一个显微镜制造商的立方体符合您的需求,您将不得不去外部商业制造商用于定制过滤器和分色镜。大多数显微镜制造商现在生产具有可拆卸激励器和屏障过滤器和可拆卸二向色镜的立方体。立方体的功能是使用激发滤光器来使激发光达到荧光色素; 以确保分色镜对期望的激发光的最大反射; 并最终采用屏障滤波器来传递期望的发射波长,但阻挡不想要的激发光或特定的不想要的发射波长。

IGS Cube - 除标准荧光立方体外,制造商还可提供用于免疫金染色的立方体。该立方体代替分色镜,具有与用于冶金明场反射光显微镜的类似的标准半透镜。取代激励滤波器,定位了长通420纳米屏障滤波器(以阻挡420以下的光线)和偏振滤波器,使偏振滤波器仅通过垂直于进入立方体的光线向东西方向振动的光线。取代立方体上的屏障滤波器,还有另一个偏振滤波器(用作分析仪),它只允许南北向光路振动的光线通过眼睛或探测器。分析仪可能被放置在相对于偏振器不太正确的交叉位置。

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多染色 - 研究人员在进行多种荧光染色时经常遇到交叉问题。例如,在使用异硫氰酸荧光素(FITC)和罗丹明共轭物的常见双重染色中,可能是激发FITC(绿色发射)的蓝色激发光也会引起罗丹明共轭物的激发(红色发射)。对于这种污渍组合,您可以尝试U-MWIBBP立方体(请参阅奥林巴斯U-URA立方体滤光片规格的数据表)。这个立方体有一个460-490纳米的带通激励滤波器,它将激发FITC。该特定立方体的屏障滤光片不是长通滤光片,而是515-550nm的带通,它将限制发射,到达眼睛或其他检测器,达到绿色波长,并阻止罗丹明的红光发射。

第二个立方体U-MNG具有用于罗丹明轭合物的绿色激发的带通激发滤波器530-550。U-MNG立方体的屏障过滤器是长通BA590,它允许若丹明的红色发射到达眼睛或其他检测器(例如电影或视频)并阻止任何绿色发射。

通过交替地将U-MWIBBP立方体和U-MNG立方体旋转到光路中,您应该能够在双染色样品中分离绿色发射的FITC和罗丹明的红色发射。(图5)同样,对于多种荧光染料的其他组合,用户必须知道荧光染料的激发 - 发射光谱和显微镜制造商提供的立方体的透射曲线。

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来自不同制造商的荧光立方体外壳通常是不可互换的,并限制在制造商提供的特定照明器内使用。图6所示的立方体显示了目前奥林巴斯提供的几种设计。应该牢记的是,一个制造商的立方体的单个元件(激发滤光片,屏障滤光片和二向色镜)有时可以调整以适合另一个制造商的立方体。这个任务留给个人用户通过反复试验来确定。

在某些情况下,可能需要寻找定制的滤光片(参见数据表中的光源)以确保所需的激发波长和/或荧光发射波长的分离。现在几个商业来源还提供定制过滤器和分色镜,安装在一个由制造商提供的单个立方体中,能够处理双荧光染色或三重荧光染色标本,而不存在交叉问题(例如DAPI和FITCDAPI和FITC &TEXAS RED,pararosaniline&acriflavin等)

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图7中显示的显微照片给出了在单个立方体内使用多个荧光滤光片成像的双染色标本的优秀实例。样品用FITC(异硫氰酸荧光素)和罗丹明 - 鬼笔环肽染色以选择性地突出微管和肌动蛋白丝。立方体是奥林巴斯WIBAWIG组合拍摄的计划荧光40X物镜和PM30自动显微摄影系统。


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