奥林巴斯:显微镜的荧光介绍

2019-06-19 16:31:23 Pooher Inc. 142

荧光是无处不在的发光过程家族中的一员,其中敏感分子通过物理(例如光吸收),机械(摩擦)或化学机理产生的电子激发态发光。通过由紫外光或可见光光子激发分子而产生的发光是一种称为光致发光的现象,其在形式上分为两类,荧光磷光,这取决于激发态的电子结构和发射路径。荧光是一些原子和分子的特性,用于吸收特定波长的光并随后在短暂的时间间隔后发射较长波长的光,称为荧光寿命。磷光过程以类似于荧光的方式发生,但具有更长的激发态寿命。

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荧光过程由三个重要事件决定,所有这些事件发生在相隔几个数量级的时间尺度上(见表1)。由入射光子激发的易感分子发生在飞秒(10E-15秒)内,而激发态电子的振动弛豫速度慢得多,可以以皮秒(10E-12秒)为单位进行测量。最后的过程,发射更长波长的光子并使分子返回基态,发生在相当长的纳秒时间(10E-9秒)内。尽管从激发到发射的整个分子荧光寿命仅在十亿分之一秒内测量,这种现象是光和物质之间相互作用的一个惊人表现形式,它构成了稳态和时间分辨荧光光谱和显微镜的扩展领域的基础。由于荧光检测的发射轮廓,空间分辨率和高度特异性非常敏感,该技术正迅速成为遗传学和细胞生物学中的重要工具。

几位研究人员在十七世纪和十八世纪报告了发光现象,但是它是英国科学家George G. Stokes爵士在1852年首先描述了荧光,并负责创造蓝白色荧光矿物萤石(萤石)的名词。斯托克斯还发现了以其名字命名的发射光谱中较长的值的波长转换。荧光是20世纪初期由几位着名科学家在光学显微镜中首先遇到的,其中包括AugustKöhler和Carl Reichert,他们最初报告说荧光在紫外显微镜中是一种麻烦。第一台荧光显微镜是由德国物理学家OttoHeimstädt和Heinrich Lehmann在1911年至1913年间从紫外线仪器衍生出来的。这些显微镜被用来观察细菌,动物和植物组织中的自发荧光。此后不久,Stanislav Von Provazek开始了一个新时代,他使用荧光显微镜研究固定组织和活细胞中的染料结合。然而,直到20世纪40年代初期,艾伯特科恩才开发出一种用荧光染料标记抗体的技术,因此诞生了免疫荧光领域。到二十一世纪之后,荧光显微镜领域引发了细胞生物学革命,将活细胞成像的能力与合成和基因编码的荧光探针的高度特异性多重标记个体细胞器和大分子复合物相结合。此后不久,Stanislav Von Provazek开始了一个新时代,他使用荧光显微镜研究固定组织和活细胞中的染料结合。然而,直到20世纪40年代初期,艾伯特科恩才开发出一种用荧光染料标记抗体的技术,因此诞生了免疫荧光领域。到二十一世纪之后,荧光显微镜领域引发了细胞生物学革命,将活细胞成像的能力与合成和基因编码的荧光探针的高度特异性多重标记个体细胞器和大分子复合物相结合。此后不久,Stanislav Von Provazek开始了一个新时代,他使用荧光显微镜研究固定组织和活细胞中的染料结合。然而,直到20世纪40年代初期,艾伯特科恩才开发出一种用荧光染料标记抗体的技术,因此诞生了免疫荧光领域。到二十一世纪之后,荧光显微镜领域引发了细胞生物学革命,将活细胞成像的能力与合成和基因编码的荧光探针的高度特异性多重标记个体细胞器和大分子复合物相结合。直到20世纪40年代早期Albert Coons开发出一种用荧光染料标记抗体的技术,从而诞生了免疫荧光领域。到二十一世纪之后,荧光显微镜领域引发了细胞生物学革命,将活细胞成像的能力与合成和基因编码的荧光探针的高度特异性多重标记个体细胞器和大分子复合物相结合。直到20世纪40年代早期Albert Coons开发出一种用荧光染料标记抗体的技术,从而诞生了免疫荧光领域。到二十一世纪之后,荧光显微镜领域引发了细胞生物学革命,将活细胞成像的能力与合成和基因编码的荧光探针的高度特异性多重标记个体细胞器和大分子复合物相结合。

荧光过程的时间范围
过渡处理速率常数时间刻度(秒)
S(0)=> S(1)或S(n)吸收(激发)瞬间10 -15
S(n)=> S(1)内部转换K(IC)10 -14至10 -10
S(1)=> S(1)振动松弛K(VR)10 -12至10 -10
S(1)=> S(0)荧光k(f)或Γ10 -9到10 -7
S(1)=> T(1)系统间交叉K(PT)10 -10至10 -8
S(1)=> S(0)无辐射
松弛淬火
k(nr),k(q)10 -7至10 -5
T(1)=> S(0)磷光K(P)10 -3至100
T(1)=> S(0)无辐射
松弛淬火
k(nr),k(qT)10 -3至100
表格1

通常用高度共轭的多环芳香族分子来研究荧光,所述多环芳香族分子存在于基态的几个能级中的任何一个,每个能级与电子分子轨道的特定排列相关联。分子的电子状态决定了负电荷的分布和整体分子几何形状。对于任何特定的分子,存在几种不同的电子状态(如S(0)S(1)S(2)所示)在图1中),取决于总电子能量和各种电子自旋态的对称性。每个电子状态被进一步细分为与原子核和键合轨道相关的许多振动和旋转能级。大多数有机分子的基态是电子单态,其中所有电子都是自旋配对的(具有相反的自旋)。在室温下,除了基态的最低振动能级以外,很少有分子具有足够的内能存在于任何状态,因此激发过程通常源于该能级。

能够经历电子跃迁最终导致荧光的分子类别被称为荧光探针荧光染料或简单的染料。通过吸附或共价键与较大的大分子(如核酸,脂质,酶或蛋白质)结合的荧光染料称为荧光团。一般来说,荧光团分为两大类,称为内在外在。内在的荧光基团,如芳香族氨基酸,神经递质,卟啉和绿色荧光蛋白,是天然存在的。外在荧光团是合成染料或改性生物化学物质,添加到样本中以产生具有特定光谱特性的荧光。

吸收,激励和排放

荧光染料对能量的吸收发生在不同分子轨道中激发态的紧密间隔的振动和旋转能级之间。荧光团吸收和发射光所涉及的各种能级典型地由Jablonski能量图(参见图1)表示,以波兰物理学家Alexander Jablonski教授的名字命名。典型的Jablonski图解说明了单重态(S(0))状态,以及第一个(S(1))和第二个(S(2))激发单线态作为一堆水平线。在图1中,较粗的线表示电子能级,而较细的线表示各种振动能态(旋转能态被忽略)。取决于过渡是与光子的吸收或发射(直线箭头)还是由分子内部转换或非辐射弛豫过程(波浪箭头)相关联,状态之间的转换被示为直线或波浪箭头。垂直向上箭头用于指示激励过程的瞬时特性,而波浪箭头则用于在更长时间范围内发生的事件。

光的吸收非常快地(大约飞秒,光子行进单个波长所需的时间)以称为量子的离散量发生并且对应于荧光团从基态到激发态的激发。同样,通过荧光或磷光发射的光子也以量子方式测量。量子(普朗克定律)中的能量用下式表示:

E =hν= hc /λ

其中E是能量,h是普朗克常数,νλ是入射光子的频率和波长,c是光速。普朗克定律指出吸收光子的辐射能量与频率成正比,与波长成反比,这意味着较短的入射波长具有更大的能量。由于光波的振荡电场矢量与分子中的电荷(电子)的相互作用而发生的由荧光团引起的能量光子的吸收是全部或不全的现象,并且只能在入射光为称为吸收带的特定波长。如果吸收的光子含有比简单电子跃迁所需的能量更多的能量,则多余的能量通常转化为振动能量和旋转能量。但是,如果分子和能量不足以促进转变的光子之间发生碰撞,则不会发生吸收。光谱宽广的吸收带来自紧密间隔的振动能级加上热运动,其使得一定范围的光子能量匹配特定的跃迁。由于通常吸收激发分子而没有电子自旋配对的变化,所以激发态也是单态。一般而言,荧光研究使用波长范围从电磁波谱(250至700纳米)的紫外至可见区域的辐射进行。

对于紫外或可见光,常见的荧光团通常被激发至第一(S(1))或第二(S(2))单态能态的较高振动水平。图1中呈现的吸收(或激发)跃迁之一(左手绿色箭头)从基态的最低振动能级到第二激发态的较高振动级(表示为S(0)的跃迁 = 0到S(2) = 3)。从基态的第二振动水平到第一激发态中的最高振动水平(表示为S(0) = 1到S(1))描绘第二激发跃迁,= 5)。在典型的荧光团中,具有宽范围波长的辐照将产生整个范围的允许跃迁,其填充激发态的各种振动能级。其中一些转变的可能性比其他转变的程度高得多,并且在组合时将构成分子的吸收光谱。请注意,对于大多数荧光团,吸收和激发光谱是不同的,但通常是重叠的,有时可能难以区分。在其他情况下(例如荧光素),吸收和激发光谱明显分开。

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在吸收光子后立即发生几个过程,其变化的概率不同,但最有可能是第一激发态的最低振动能级(S(1) = 0;图1)的弛豫。这个过程被称为内部转换振动松弛(在没有光发射的情况下损失能量),并且通常发生在皮秒或更小。由于大量的振动周期在激发态的寿命期间发生,因此分子在其激发寿命期间实际上总是经历完全的振动松弛。过量的振动能量转化为热量,在与激发态荧光团碰撞时,热量被邻近的溶剂分子吸收。

激发的分子在最后激发的单线态(S(1))中存在几纳秒量级(荧光过程中最长的时间段几个数量级),然后最终放松到基态。如果从这个长寿命状态的放松伴随着光子的发射,该过程在形式上被称为荧光。基态的紧密间隔的振动能级在与正常热运动耦合时,在发射期间产生宽范围的光子能量。结果,荧光通常作为整个波段的发射强度而不是尖锐的线来观察。在高反应性激发态分子之前,大多数荧光团可重复激发和发射循环数百次至数千次光漂白,导致荧光的破坏。例如,经过深入研究的探针异硫氰酸荧光素(FITC)可以在分子不再响应入射光照前进行大约30,000次循环的激发和弛豫。

其他几种具有不同程度概率的放松途径与荧光发射过程竞争。激发态能量可作为热以非辐射方式消散(如图1中的青色波浪箭头所示),激发的荧光团可与另一分子碰撞以在第二种类型的非辐射过程中传递能量(例如淬火,如图1中紫色波浪箭头所示),或者出现称为系间窜到最低激发三重态的现象(图1中的蓝色波浪箭头)。后者事件相对较少,但最终导致通过磷光发射光子或转变回激发的单态,从而产生延迟的荧光禁止从三重激发态到单重态基态的转变,这导致三重态发射的速率常数比荧光的低几个数量级。

两种三重态转变都在图1所示的Jablonski能量分布图的右侧示出。系统间交叉的低可能性源自这样的事实,即分子必须首先进行自旋转变产生不成对的电子,这是一个不利的过程。三态态的主要重要性在于分子在这种状态下表现出的高度化学反应性,这常常导致光漂白和产生有害的自由基。在生物样品中,溶解氧对于三重态荧光团是非常有效的猝灭剂。通常为三重态的基态氧分子可以被激发为反应性单态,导致漂白荧光团或对活细胞表现出光毒性效应的反应。三重态的荧光团也可以直接与其他生物分子反应,通常导致两种物质失活。含有重原子的分子,如卤素和许多过渡金属,

从基态(S(0))到激发单重态(S(1))发生跃迁的概率取决于电子驻留在基态时振动和旋转能态之间的相似程度,如图2所示。图2所示的弗兰克 - 康登能量图给出了地面各种能级(S(0))和第一激发(S(1))的振动能量概率分布。)陈述了一个假想的分子。在如此短的时间范围内(飞秒),从地面到激发态的激发跃迁(红线)发生在与键轨道相关联的核间距离没有足够时间改变的地方,因此这些跃迁表现为垂直线。这个概念被称为弗兰克 - 康登原则。最大吸收的波长(中心的红线)表示基态中最可能的核内分离至激发态允许的振动能级。

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在室温下,热能不足以显着占据激发态能量,而电子最可能的状态是基态(S(O)),其中包含许多不同的振动能量状态,每个都有不同的能量水平。最受欢迎的转换将是旋转和振动电子密度概率在基态和激发态中最大重叠的那些转换(见图2)。然而,不同波长(和量子)的入射光子可能有足够的能量被吸收,并且常常产生其他核内分离距离和振动能级的转变。这种效应产生了包含多个峰的吸收光谱(图3)。与荧光团中的吸收跃迁相关的光子能量范围广泛导致产生的光谱显示为宽带而不是离散线。

图3所示的假想吸收光谱(蓝色带)是由几种有利的从基态到最低激发能态(分别标记为S(0)S(1))的电子跃迁产生的。叠加在吸收光谱上的是垂直线(黄色),表示从基态中的最低振动水平到激发态中较高振动能级的转变。请注意,跃迁到最高激发振动能级是在较高光子能量(较低波长或较高波数)下出现的振动能级。与电子跃迁有关的近似能量以电子伏特(eV)表示)沿着图3的上横坐标。与地面和激发状态相关的振动水平也包括在右手坐标中。

扫描荧光团的吸收光谱,同时记录单个波长(通常是最大发射强度的波长)的发射强度,将产生激发光谱。类似地,在扫描发射波长的同时激发单个波长(再次,优选最大吸收波长)的荧光团将揭示发射光谱分布。激发和发射光谱可以被认为是概率分布函数,其中给定量子能量的光子将被吸收并且最终使荧光团能够以荧光辐射的形式发射第二光子。

斯托克斯班和镜像规则

如果仔细检查荧光团的荧光发射光谱,几个重要特征将变得很明显。由于从较高的初始激发态到S(1)的最低振动能级的快速内部转换,发射谱与激发能(波长)无关,兴奋状态。对于许多常见的荧光基团,振动能级间距对于基态和激发态是相似的,这导致荧光光谱非常类似于吸收光谱的镜像。这是因为相同的转变对吸收和发射都是最有利的。最后,在解决方案中(通常研究荧光团),详细的振动结构通常会丢失,发射光谱显示为宽带。

如前所述,在光子吸收之后,激发的荧光团将快速经历松弛至激发态的最低振动能级。这种快速内部转换的一个重要结果是所有后续的弛豫途径(荧光,非辐射松弛,系统间交叉等)都从激发态的最低振动水平(S(1))开始。与吸收一样,处于激发态的电子将返回到基态的特定振动能级的概率与各状态下能级之间的重叠成正比(图2)。返回转换到基态(S(0))通常发生到更高的振动水平(见图3),随后达到热平衡(振动松弛)。因为光子的发射常常使荧光团离开较高的振动基态,所以发射光谱典型地是从地面到第一激发态跃迁产生的吸收光谱的镜像。实际上,电子返回到基态的特定振动能级的概率类似于在激发之前电子在基态的位置的概率。这个概念被称为镜像规则在图3中示出了从激发态的最低振动能级返回基态的各种振动能级的发射跃迁(蓝线)。产生的发射光谱(红色波段)是假想发色团显示的吸收光谱的镜像。

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在许多情况下,高能光子激发导致更高的电子和振动能级(S(2)S(3)),等),当荧光团放松至第一激发态的最低振动水平时,其迅速失去过量能量(见图1)。由于这种快速弛豫过程,发射光谱通常独立于激发波长(一些荧光团从较高能态发射,但这种活性很少见)。由于这个原因,发射是基态到最低激发态跃迁的镜像,但不是整个吸收谱的镜像,其可能包括跃迁到更高能级。镜像规则的一个很好的测试是检查波数(波长的倒数或每厘米波的数量)的线性图中的吸收和发射光谱,其与频率和量子能量成正比。当以这种方式呈现时(见图3),

图4显示了奎宁的吸收和发射光谱,奎宁是自然发生的抗疟药(和第一种已知的荧光团),其荧光特性最初由约翰弗雷德里克威廉赫歇尔爵士于1845年描述。奎宁并不遵守镜像规则通过检查发射光谱(在460纳米处)的单峰来证明,其不反映双峰吸收光谱中在310和350纳米处的两个峰。较短波长的紫外吸收峰(310纳米)是由于激发跃迁到第二激发态(从S(0)S(2)),其迅速弛豫到最低激发态(S(1))。因此,荧光发射完全来自最低激发单重态(S(1)),从而产生一个光谱,在奎宁中反射地面为第一激发态跃迁(350纳米峰值),而不是整个吸收光谱。

因为与荧光发射跃迁相关的能量(见图1-4)通常小于吸收的能量,所产生的发射光子具有较少的能量并且转移到较长的波长。这种现象通常被称为斯托克斯位移Stokes Shift),并且发生在溶液研究中常用的所有荧光团。斯托克斯位移的主要来源是激发电子迅速衰减到S(1)的最低振动能级,兴奋状态。此外,荧光发射通常伴随着向基态的更高振动能级的跃迁,导致激发能量的进一步损失以热量平衡过量的振动能量。其他事件,例如溶剂取向效应,激发态反应,复合物形成和共振能量转移也可以促成较长的发射波长。

在实践中,斯托克斯位移被测量为特定荧光染料或荧光团的激发和发射光谱中最大波长之间的差异。偏移的大小随分子结构而变化,但范围可以从几纳米到几百纳米。例如,荧光素的斯托克斯位移大约为20纳米,而奎宁的位移为110纳米(见图4),卟啉的位移超过200纳米。斯托克斯频移的存在对荧光成像测量的极高灵敏度至关重要。

消光系数,量子产量和荧光寿命

描述和比较荧光团时常用的三个基本参数是消光系数(ε),量子产额(Φ)和荧光寿命(τ)。摩尔消光系数广泛用于光谱学,显微镜和荧光领域,以将吸光度单位转换为各种化学物质的摩尔浓度单位。消光系数通过测量一个摩尔(M)的参考波长(吸收分子的特征)的吸光度来确定)浓度(1摩尔/升)目标化学物质在具有1厘米路径长度的比色杯中。参考波长通常是紫外或可见光谱中最大吸收波长。消光系数是荧光团吸收光的能力的直接量度,具有高消光系数的那些发色团也具有很高的荧光发射概率。此外,因为荧光团的固有寿命(下面讨论)与消光系数成反比,所以表现出高消光系数的分子具有短的固有寿命的激发态。

量子产额(有时被错误地称为量子效率)是测量荧光发射相对于所有可能的弛豫途径的效率的标准,并且通常表示为发射的光子与吸收的光子数量的(无量纲)比率。换句话说,量子产额表示给定的激发荧光染料将产生发射光子(荧光)的概率。量子产额通常介于0和1之间,荧光分子通常在显微镜中用作探针,量子产率范围从非常低(0.05或更小)到几乎一致(最亮的荧光团)。一般来说,在大多数成像应用中,高量子产率是理想的。给定荧光团的量子产率随着环境因素(例如pH,浓度和溶剂极性)而变化,有时甚至变成极大的极端。

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荧光寿命是分子在返回到基态之前保持激发状态的特征时间,并且是可用于从发射分布中收集信息的时间的指标。在激发态寿命期间,荧光团可以发生构象变化以及与其他分子相互作用并在局部环境中扩散。通过指数函数来描述在用短暂的光脉冲激发的均匀分子群体中作为时间的函数的荧光强度的衰减:

I(t)= I o ·e (-t /τ)

其中I(t)是在时间t测量的荧光强度,I(o)是激发后立即观察到的初始强度,并且τ是荧光寿命。形式上,荧光寿命定义为荧光团的初始荧光强度衰减到初始强度的1 / e(约37%)的时间(见图5(a))。该量是从激发态到基态的荧光衰减的速率常数的倒数。

由于荧光水平与激发单态中的分子数量成正比,所以寿命测量可以通过在短暂的激发脉冲之后测量荧光衰减来进行。在均匀溶剂中,荧光衰减通常是单指数函数,如图5(a)和5(b)中荧光强度与时间的关系图所示。更复杂的系统(如活组织和活细胞)包含混合环境,当测量荧光衰减时,这些环境通常会产生多指数值(图5(c))。此外,其他几个过程可以与荧光发射相竞争,使激发态电子返回到基态,包括内部转换,磷光(系统间交叉)和淬灭。

所有能够激发态电子失活的非荧光过程可以方便地组合成单一速率常数,称为非辐射速率常数,并由变量k(nr)表示。非辐射率常数通常忽略振动弛豫的贡献,因为这些转换的快速速度(皮秒)比慢速禁用(纳秒)转换快几个数量级。因此,量子产率现在可以用速率常数表示:

Φ=光子发射/光子吸收= K ˚F /(K ˚F + K NF)=τ ˚F /τ ö

其中k(f)是荧光衰减的速率常数(符号Γ也用于表示该速率常数)。衰变速率常数的倒数等于本征寿命τ(o)),其定义为在缺乏所有激发态失活过程的情况下激发态的寿命。实际上,通过非辐射过程缩短了荧光激发态寿命,导致测量寿命(τ(f)),其是本征寿命和竞争性非荧光弛豫机制的组合。由于测量的寿命总是小于固有寿命,因此量子产额永远不会超过统一值。

光学显微镜中使用的许多常用探针的荧光寿命都以纳秒为单位进行测量,但这些可以在很宽的范围内变化,这取决于分子结构,溶剂和环境条件。定量荧光寿命测量使研究人员能够区分具有相似光谱特征但寿命不同的荧光团,并且还可以为当地环境提供线索。具体而言,可以在不知道局部荧光团浓度的情况下确定探针附近的离子的pH值和浓度,当与探针浓度可能不均匀的活细胞和组织一起使用时,荧光团浓度是显着的。另外,寿命测量对光漂白伪像的敏感度低于强度测量值。

淬火和光漂白

淬灭和光漂白的后果是有效减少排放量,并应在设计和执行荧光检查时作为首要考虑因素。这两种现象是不同的,因为猝灭通常是可逆的,而光漂白不是。淬火产生于各种竞争过程,这些过程引起激发态电子的非辐射弛豫(没有光子发射)到基态,其本质上可以是分子内或分子间的。由于非辐射跃迁途径与荧光弛豫竞争,它们通常大大降低或在某些情况下完全消除辐射。大多数淬灭过程用于减少激发态寿命和受影响荧光团的量子产率。

在激发态荧光团与溶液中的另一个(非荧光)分子碰撞时观察到一个常见的淬灭实例,导致荧光团失活并返回基态。在大多数情况下,两种分子在碰撞淬灭过程中都没有发生化学变化。各种各样的简单元素和化合物表现为碰撞猝灭剂,包括氧,卤素,胺和许多缺电子有机分子。碰撞淬灭可以揭示局部猝灭剂分子或部分的存在,其通过扩散或构象变化可能在激发态寿命期间与荧光团发生碰撞。碰撞猝灭的机制包括电子转移,自旋轨道耦合和系统间跃迁到激发三重态。通常与碰撞淬灭交替使用的其他术语是内部转化和动态淬灭。

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第二种类型的淬火机制,称为静态复杂猝灭是由猝灭剂和荧光团之间形成的非荧光复合物引起的,其通过减少活性的,可激发分子的数量来限制吸收。当荧光物质与基态中的猝灭剂分子形成可逆复合物并且不依赖于扩散或分子碰撞时,发生这种效应。在静态淬灭中,荧光发射减少而不改变激发态寿命。处于激发态的荧光团也可以通过偶极共振能量转移机制来猝灭,此时该激发态能量可非辐射转移到受体分子上。在某些情况下,淬灭可以通过非分子机制发生,例如吸收物质(包括发色团本身)对入射光的衰减。

与淬火相比,光漂白(也称为褪色)发生在荧光团由于光子诱导的化学损伤和共价修饰而永久失去发荧光能力时发生。从激发的单线态跃迁到激发的三线态后,荧光团可能与另一个分子相互作用产生不可逆的共价修饰。三重态相对于单态而言相对较长,因此允许激发分子在更长的时间范围内与环境中的组分发生化学反应。在光漂白之前特定荧光团发生的激发和发射周期的平均数取决于分子结构和当地环境。一些荧光团在仅发射少量光子后快速漂白,而另一些荧光团在漂白之前可以经历数千或数百万次循环。

图6中显示的是在不同时间点捕获的一系列数字图像中观察到的光漂白(褪色)的典型例子,用于牛肺动脉上皮细胞的多重染色培养物。细胞核用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色; 蓝色荧光),而线粒体和肌动蛋白细胞骨架分别用MitoTracker Red(红色荧光)和鬼笔环肽衍生物(绿色荧光)染色。使用荧光滤光片组合以两分钟的时间间隔拍摄时间点,所述荧光滤光片组合的带宽经调谐以同时激发三个荧光团,同时还记录组合的发射信号。请注意,图6(a)中所有三种荧光团都具有相对较高的强度,但DAPI(蓝色)强度在两分钟时开始迅速下降,在六分钟后几乎完全消失。线粒体和肌动蛋白染色对光漂白更有抵抗力,但在定时序列(10分钟)期间两者的强度均下降。

一类重要的光漂白事件是光动力学,这意味着它们涉及荧光团与光和氧的组合的相互作用。荧光团和分子氧之间的反应会永久破坏荧光并产生可以化学修饰活细胞中其他分子的自由基单线态氧。由光动力学事件引起的光漂白量是分子氧浓度和荧光团,氧分子和其他细胞组分之间的近端距离的函数。通过限制荧光团照射的时间或降低激发能量可以减少光漂白。但是,这些技术也会减少可测量的荧光信号。在许多情况下,荧光团或细胞悬液的溶液可以脱氧,但这不适用于活细胞和组织。

在某些情况下,光漂白效果也可以用来获得不可用的特定信息。例如,在光漂白(FRAP)实验之后的荧光恢复中,目标区域内的荧光团有意地被过度水平的辐照漂白。当新的荧光团分子扩散到样本的漂白区域(恢复)时,监测荧光发射强度以确定目标荧光团的横向扩散速率。以这种方式,荧光标记分子的平移迁移率可以在单个细胞或活组织切片的非常小的(2至5微米)区域内确定。

溶剂对荧光发射的影响

多种环境因素影响荧光发射,包括荧光团与周围溶剂分子之间的相互作用(由溶剂极性决定),其他溶解的无机和有机化合物,温度,pH以及荧光物质的局部浓度。这些参数的影响从一个荧光团到另一个荧光团变化很大,但吸收和发射光谱以及量子产率可能受环境变量的严重影响。事实上,荧光的高度敏感性主要是由于在激发态寿命期间在局部环境中发生的相互作用。荧光团可以被认为是处于激发态(比基态)完全不同的分子,

在解决方案中,围绕基态荧光团的溶剂分子也具有偶极矩,其可以与荧光团的偶极矩相互作用以在荧光团周围产生溶剂分子的有序分布。荧光团中的基态和激发态之间的能级差异引起分子偶极矩的变化,其最终诱导周围溶剂分子的重排。然而,Franck-Condon原理规定,在激发荧光团后,分子在较短的时间范围内被激发至较高的电子能级,这与荧光团和溶剂分子在溶剂溶质中将其自身重新定向互动环境。结果是,

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在荧光团被激发至第一激发单重态(S(1))的较高振动水平之后,随着荧光团缓慢松弛至最低振动能级(在皮秒时间内发生),过量的振动能量迅速损失至周围溶剂分子规模)。溶剂分子通过重新定向帮助稳定并进一步降低激发态的能级(称为溶剂松弛)在激发的荧光团周围以较慢的过程需要10到100皮秒。这具有减少基态和激发态之间的能量分离的效果,这导致荧光发射的红移(对较长波长)。增加溶剂极性会使激发态的能级相应地降低,而降低溶剂极性则会降低溶剂对激发态能级的影响。荧光团的极性也决定了激发态对溶剂效应的敏感性。极性和带电荧光团显示出比非极性荧光团更强的作用。

溶剂对荧光的松弛效应可能对斯托克斯位移的大小产生显着影响。例如,氨基酸色氨酸的杂环吲哚部分通常驻留在周围介质的相对极性较低的蛋白质的疏水内部。用热或化学试剂使典型的宿主蛋白质变性后,随着吲哚环进入周围的水溶液中,色氨酸残基的环境从非极性变成高极性。由于溶剂效应,荧光发射在从约330纳米到365纳米的波长范围内增加,这是一个35纳米的位移。因此,本征和外在荧光探针的发射光谱可用于探测溶剂极性效应,分子缔合,

定量荧光调查应持续监测,以便扫描排放情况中的潜在变化,即使这些变化无意或无意。在可以建立均匀浓度的简单系统中,随着荧光团浓度的增加,应该观察到逐渐增加的发射强度增加,反之亦然。然而,在复杂的生物系统中,荧光探针浓度可能在很宽的范围局部变化,并且强度波动或光谱漂移通常是pH,钙离子浓度,能量转移或淬灭剂而不是荧光团存在的结果化学计量。在评估实验程序的结果时,应始终考虑出现意外溶剂或其他环境影响的可能性。

荧光各向异性

当内部或外部荧光团被平面偏振光激发时,来自各种样品的荧光发射变得极化。根据各向异性描述极化发射的水平,并且显示某种程度各向异性的样本也显示可检测的极化发射水平。荧光各向异性的观察和测量基于荧光团的光选择性激发,这是由于吸收偶极矩与照射光子(偏振光)的定向电场矢量的瞬时对准。当荧光团吸收入射光子时,激发事件由入射辐射的振荡电场分量与由荧光分子轨道的电子状态产生的跃迁偶极矩之间的相互作用产生。荧光团优先吸收具有与荧光团的吸收跃迁偶极矩平行排列的电场矢量的那些光子。

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荧光发射也发生在由发射跃迁偶极矩定义的平面中。每个荧光团在其分子框架内固定了一个吸收和发射跃迁偶极矩(图8),它们相对于染料分子的分子轴具有确定的取向,并且彼此间隔一个角度(θ)。图8中显示了假设的三核芳香杂环荧光团(排列类似于吖啶环系统),其上覆盖有代表吸收(黄色箭头)和发射(红色箭头)跃迁偶极矩矢量的空间关系的箭头。在激发态寿命期间(τ),荧光团的旋转将使其发射相对于激发矢量去极化,从而导致用于测量含有荧光团的环境的刚性的机制。

含有具有平面偏振光的随机取向荧光团的各向同性溶液的照射将优先仅激励其吸收跃迁偶极矩与偏振电矢量平面平行(或几乎如此)排列的那些分子。吸收的可能性实际上与偶极子和入射光的电场矢量之间的角度的余弦平方成正比(当角度为零度时吸收最大并且当角度接近90度时达到最小值)。结果将是来自原始集合的激发荧光团亚群的特定光选择过程,产生平行于特定轴取向的激发态荧光团。这个亚群的荧光发射也将部分极化。p)或各向异性(r),如等式所示:

P =(I || - I )/(I || + I R =(I || - I )/(I || + 2I 

其中I(||)是在平行于激发平面的平面内测得的荧光发射,I(⊥)是在垂直于激发平面的平面内测得的荧光发射。实际上,通过测量用放置在激发光路径中的偏振器收集的发射以及放置在与激励偏振器平行或垂直取向的发射光路中的分析仪来计算偏振光量(参见图9)。各向异性和极化都是相同现象的表达式,并且这些值可以很容易地相互转换。在大多数情况下,各向异性表达式是优选的,因为当用该参数表示时,相关的数学方程式更简单。

由于发射跃迁偶极矩由于空间取向而从激发跃迁时刻偏移(见图8),即使荧光团固定在适当位置,也会出现一定程度的去极化。因此,吸收过程本身是荧光去极化的第一来源。荧光团的旋转运动(其总是在激发态的寿命期间发生)导致发射跃迁偶极子从原始方向上的额外位移,并且将进一步降低观测的发射各向异性。旋转速率取决于荧光团的大小(或与之结合的大分子)和其局部环境的粘度。

0 / r = 1 +(RTτ)/(ηV)

其中r(0)是限制各向异性(在不存在任何荧光团旋转的情况下观察到的各向异性),r是测量的各向异性,η是环境的粘度,V是旋转分子的体积,R是通用气体常数,T是Kelvin刻度上溶液的温度,τ是荧光团激发态的寿命。在实践中,Perrin等式被降低以表示荧光团的旋转相关时间Φ)方面的各向异性的时间依赖性衰减:

0 / r = 1 +τ/Φ其中Φ=(ηV)/(RT)

导致(较低)测得的荧光各向异性值偏离最大理论极限的现象之一是在激发态寿命期间发生的分子的自然旋转扩散。在解决方案中,小分子荧光团(高达数千道尔顿)具有50-100皮秒的旋转相关时间,其显着快于发射速率并且排出或随机分布发射跃迁偶极矩。由于典型荧光团的平均激发态寿命在纳秒范围内,分子在发射前能够旋转多次。结果,偏振发射是随机的,因此净各向异性为零。

荧光团与大得多的大分子的缔合导致旋转相关时间的显着增加。在大多数情况下,溶液中大蛋白质的相关时间范围为10到50纳秒,等于或超过典型荧光团的平均激发态寿命。荧光团的结合减慢了荧光探针的旋转运动并且能够研究宿主蛋白质的旋转相关时间。较小的蛋白质通常比较大的蛋白质或参与复杂生物组装的蛋白质显示出更短的相关时间,并且可以预期产生较低的各向异性。

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用光学显微镜测量荧光偏振的仪器方法如图9所示。平面偏振激发光是通过使来自电弧放电照明器的光通过线性偏振器而产生的。平面偏振激发光被吸收偶极矩平行于激发光平面取向的样品(在显微镜载片上)中的荧光团最大程度地吸收。这导致荧光团的特定亚群被激发(荧光团的各向异性集合)。理论上,所有激发的荧光团都具有相同的吸收和发射偶极矩方向。随后相对于激发照明的偏振平面在平行和垂直方向上测量由荧光团发射的荧光。当荧光团在其激发态寿命期间旋转时,平行于激发平面观察到的发射水平将不断降低,而垂直于激发平面记录的发射量将同时增加。

如上所述,荧光各向异性测量可以提供关于蛋白质的旋转迁移率的信息,从中可以推断出它们的分子量和形状。另外,可以监测分子间缔合,以及构象变化和蛋白质变性。该技术也被用于检测蛋白质的内在灵活性和生物膜的一些物理性质,包括粘度,相变,化学组成以及膜扰动对这些性质的影响。荧光各向异性测量可以在使用连续照明的稳态系统或利用脉冲激发事件的时间分辨实验中进行。

共振能量转移

如上所述,处于激发态的荧光团可通过将其转化成光(荧光),通过热平衡(振动松弛)或通过碰撞或复合物形成转移到另一分子而失去激发能量(非辐射耗散和淬灭)。在形成复合物或与溶剂分子碰撞时,能量通过荧光团和第二分子之间的电子轨道的偶联而转移。还有另一个过程,称为共振能量转移(RET),通过该过程,处于激发态的荧光团(称为供体)可以将其激发能量转移到相邻的发色团(受体)通过长距离的偶极 - 偶极相互作用以纳米测量的距离非辐射地进行。共振能量转移的基本理论假设供体荧光团可以被视为振荡偶极子,其可以以类似于耦合振荡器的行为的方式将能量转移到类似偶极子,所述耦合振子例如是一对调谐叉振动以相同的频率。

无论何时供体荧光团的发射光谱与受体的吸收光谱重叠,共振能量转移都是可能的,其本身不一定是荧光的。理解这种能量转移机制的一个重要概念是该过程不涉及来自供体的光的发射,随后由受体随后吸收发射的光子。换句话说,共振能量传递机制中没有涉及中间光子。能量转移通过在受体存在下猝灭供体荧光发射和增加(敏化)受体荧光发射来表现。

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图10中显示了来自经历共振能量转移的偶联供体和受体分子的光谱分布的发射强度的变化。供体发射(中心灰色曲线)和受体吸收光谱(中心黄色曲线)之间需要重叠(灰色区域)才能使过程发生。当存在这种重叠,并且供体和受体分开的范围小于10纳米时,可以将供体激发能量非辐射地转移给受体。最终结果是猝灭供体荧光发射(红色曲线)和受体发射强度增加(敏化发射,红色虚线)。图10中的供体和受体的单个光谱分布图可以使用图左上角的图例进行识别。

共振能量转移的效率随着光谱重叠程度而变化,但最重要的是作为距离的六次幂的倒数(半径r)分离供体和受体发色团。将能量传递给受体需要发色团之间的距离相对接近,在1至10纳米的限制范围内。该现象可以通过激发具有对应于供体的吸收(激发)最大值的照射波长的标记样本并检测受体的峰值发射波长区域中的荧光发射来检测。或者,可以在存在和不存在受体的情况下测量供体的荧光寿命。能量转移效率对供体和受体间分离距离的依赖性为细胞生物学研究中共振能量转移的应用提供了基础。共振能量转移的这一方面使得该技术能够被用作a光谱统治者研究和量化细胞组分之间的相互作用,以及个体大分子内的构象变化,在分子水平上。

为了发生共振能量转移,必须建立一组特定条件。供体发色团必须能够以合理的量子产率与足够长的寿命耦合并且供体和受体分子之间的距离相对较短(在大多数情况下仅为几纳米)。另外,如上所述,共振能量转移研究的设计不涉及受体实际重新吸收光。能量转移率(K(T))和能量转移效率(E(T))都与受体存在或不存在时供体的寿命有关。能量转移速率常数表示为:

ķ Ť =(1 /τ d)•(R 0 / R)6

其中R(0)临界弗斯特距离,它是施主 - 受主分离半径,其中在不存在受体的情况下能量转移的概率等于施主去激励(衰减)速率的概率。因此,对于大多数共振能量转移测量,Förster距离通常介于2到7纳米之间,是能量转移效率为50%的发色团之间的距离。同样在该等式中,τ(D)是用于表示在不存在受体的情况下供体的寿命的变量,并且r是分离供体和受体分子的距离。通过研究该方程,可以清楚地看出,当发色团之间的半径等于Förster距离时,在没有受体的情况下共振能量转移速率等于供体衰变速率(寿命的倒数)。此时,转移效率为50%,并且在没有受体的情况下,供体发射会降低到正常强度的一半。因为能量转移的速率与分离距离的六次方成反比,供体和受体之间的接近性显然是占主导地位的术语。以纳米表示的关键福斯特距离根据以下公式计算:

[R 0 = 2.11×10 -2 •[η -4 Q 0 κ 2 Ĵ(λ)] 1/6

福斯特距离方程介绍的概念κ 2κ平方),这是一个取向因子描述在三维空间中的供体和受体的吸收和发射偶极之间的空间关系。如果偶极取向在两个发色团之间是随机的(由于供体和受体分子的快速旋转),对于大多数R(0)的计算,取向因子等于统计平均值(值为2/3或0.67 。发生能量转移的介质的折射率由变量η表示,并且Q(0)是在不存在受体的情况下供体的量子产率。重叠积分,J(λ)定义了供体发射光谱和受体吸收光谱之间的重叠面积(如图10中的灰色阴影部分所示)。能量转移效率(E(T))与通过以下等式分离供体和受体(r)的距离有关:

R = R 0 [(1 / E Ť) - 1] 1/6其中ë Ť = 1 - (τ DA /τ d

因此,通过在存在受体(τ(DA))且不存在受体(τ(D))的情况下测量供体的荧光寿命,),可以确定分离两种发色团的能量转移效率和距离。由于共振能量转移的效率在供体寿命期间受供体和受体的扩散严重影响,时间分辨测量最适合于空间波动系统的分析。转移效率也可以通过使用供体在存在和不存在受体时的相对荧光发射强度的稳态技术来测量。然而,这些计算仅限于供体和受体分开固定距离的情况,例如当两种发色团都结合到相同的大分子上时。对于与不同蛋白质或蛋白质和核酸结合的供体和受体来说情况并非如此,时间分辨信息通常是必需的。

共振能量转移研究提供了独特的信息,与荧光各向异性,溶剂松弛,猝灭或大多数激发态反应的替代实验相比。大多数定量荧光测量依赖于荧光团和紧邻附近的其他分子(包括周围溶剂分子)之间的短程相互作用。相反,溶剂效应,甚至是大分子(如蛋白质或核酸)的存在对供体和受体之间能量转移的效率几乎没有影响。与其他技术不同,测量共振能量转移时考虑的主要因素是供体分子和受体分子之间的实际物理距离。

结论

尽管荧光现象看起来几乎是瞬时的,但就目前的仪器而言,光子吸收和荧光发射第二个光子之间的相对较长的时间框架为使用这种非凡方法的大量研究打开了大门。荧光技术的调色板包括可观察到的吸收和发射光谱,量子产率,寿命,淬灭,光漂白,各向异性,能量转移,溶剂效应,扩散,复合物形成以及大量环境变量的变化。所有这些因素都可以通过对内在和外在荧光团的光谱性质进行稳态或时间分辨解释来评估。

当与光学显微镜耦合时,荧光使研究人员能够研究细胞生物学中广泛的现象。最重要的是分析亚细胞组合体中特定大分子的细胞内分布,如核,膜,细胞骨架细丝,线粒体,高尔基体和内质网。除了细胞解剖学的稳态观察之外,荧光还可用于探测细胞内动力学以及各种大分子之间的相互作用,包括扩散,结合常数,酶促反应速率以及各种反应机制,用于时间分辨测量。其他重要的过程也是使用荧光显微镜可获得的高度特异性和空间分辨率进行研究的目标。例如,荧光探针已用于监测细胞内pH和重要离子的局部浓度,以及用于研究细胞活力和影响细胞凋亡速率的因素。同样,重要的细胞功能,如内吞作用,胞吐作用,信号转导和跨膜电位产生已经用荧光显微镜进行研究。在回顾从荧光分析中受益的大量应用时,很明显为什么荧光显微镜的显着效用已经将这一技术推向了生物医学研究的前沿。用荧光显微镜研究了胞吞作用,胞吐作用,信号转导和跨膜电位生成等重要的细胞功能。在审查从荧光分析中受益的大量应用时,很明显为什么荧光显微镜的显着效用已将此技术推向了生物医学研究的前沿。用荧光显微镜研究了胞吞作用,胞吐作用,信号转导和跨膜电位生成等重要的细胞功能。在审查从荧光分析中受益的大量应用时,很明显为什么荧光显微镜的显着效用已将此技术推向了生物医学研究的前沿。


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