奥林巴斯微分干涉显微镜调试方法

2019-06-19 16:31:23 Pooher Inc. 178

只要仪器能够接受偏振滤光片和专门设计的聚光镜物镜棱镜(以及外壳),微分干涉对比(DIC)光学元件可以安装在任何明场透射,反射或倒置的显微镜上,技术。

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所有主要的显微镜制造商都为他们的研究级显微镜生产DIC附件,这些附件经常被捆绑在一起,作为包含所有所需硬件和光学元件的匹配套件。在标准配置中,微分干涉对比显微镜(见图1)包含通常在偏振光显微镜上遇到的偏振元件,此外还有两个特殊构造的双折射复合棱镜。Termed WollastonNomarski棱镜,这些光学分束器(和光束组合器)定位成将剪切波前的干涉图案投影到聚光镜前焦平面和物镜后焦平面。

图1中显示了传输差分干涉对比显微镜的典型光学列车配置。从灯丝中的局部邻域发出的半相干波前通过位于显微镜基座中的光端口和冷凝器组件之间的线性偏振器。复合Nomarski或Wollaston棱镜位于聚光器孔径(前焦平面)内或其附近,用于将入射偏振波前对准并剪切成两个正交分量。垂直剪切波前由聚光透镜系统聚焦成平行束,平行束横穿样本平面,并根据样本的光程长度参数通过变形对折射率和厚度梯度作出响应。

物镜聚集的光波汇聚在第二个Nomarski棱镜所在的后焦平面上。目标Nomarski棱镜将剪切和变形的波前重新组合成线性和椭圆偏振光,随后使分量通过位于物镜上方的中间管中的分析器(垂直于分极偏振器定向的第二偏振器)。最后,从分析仪出射的线性偏振光分量在目镜光阑(或相机投影透镜)的图像平面通过相长干涉和相消干涉重新组合。

DIC显微镜的偏振元件

在DIC显微镜中使用的偏振器与用于偏振光观察的偏振器类似或相同,但是许多制造商提供匹配的DIC偏振滤光器,其具有低和高光传输效率。在放大倍数范围(40x,60x和100x)的上端,DIC优先使用具有高透射效率的偏振器,因为样品细节更清晰,并且较大的偏置延迟值可用于视频和数字成像。低透射偏振滤光片对于使用10倍和20倍物镜的DIC观察是有用的,但是在较高放大倍数下严重限制光透射。

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在大多数显微镜上,偏振器直接安装在仪器底座的光源端口或安装在冷凝器下方的滤光片支架上。设计用于跨越光端口的偏光镜通常安装在旋转组件中,使显微镜工作人员能够将滤光镜旋转90度至180度角(见图2(a))。一旦旋转偏振器定位在所需的传输方位,它可以用锁定螺钉固定到位。按照惯例,起偏器的取向是振动传播轴位于东西方向(当站在显微镜前时从左到右)。将偏振器连接到底座聚光器安装支架的显微镜配备有可以或不可以使偏振器旋转的外壳(图2(b)和2(c))。具有圆形几何形状的偏光镜可装入舞台上的支架中,并可通过一个缓冲装置以固定增量45度旋转。其他偏振片安装在矩形框架内,可滑入冷凝器支架中的一个槽中(图2(b)和2(c)),并且通常包含可在180至360度范围内旋转的指轮。

分析仪放置在目标Nomarski棱镜和配备DIC观察的显微镜中的目镜观察管之间,类似于这些组件在偏光显微镜中的位置。该分析仪也是一个线性偏振器,它的传输方位与偏振器的方向成90度角。按照惯例,分析仪的振动方向为北 - 南,与偏振器规定的东西方位重合。

分析仪的显微镜安装配置与偏光镜的安装配置相同,并且这些部件通常插入到光学系统中的许多位置。在某些显微镜中,分析仪被固定在一个矩形框架中(图2(e)),并插入鼻镜,中间管或垂直照明器的槽中。其他分析仪设计具有相同的框架样式,但是可以使用通常以10,45或90度增量分度的指轮旋转分析器元件(图2(f))。配备DIC观察的偏光显微镜常常将分析仪放置在位于物镜鼻镜和观察管之间的中间管中(见图2(d))。这些装置通常设计用于偏振光下的精密测量,并具有环绕圆周的360度刻度游标刻度,并具有锁定机制,可将分析仪固定在所需的传输方位角上。此外,分析仪通常安装在滑块上,因此可以方便地从光路中移除以进行线性偏振或明场观测。偏光显微镜的中间管也包含20×6毫米DIN标准插槽用于四分之一波长,全波或德塞纳蒙补偿器(图2(d)和图5)。

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现代显微镜将偏光镜和分析仪定位在与现场镜头,冷凝器,物镜和观察管相关的重要位置。在较老的显微镜中,这些偏振元件可以安装在各种各样的位置。然而,应该注意的是,将偏振元件放置在共轭图像平面内(或非常接近共轭图像平面(视场光阑,样品台或目镜固定光圈))并不是一个好主意,因为玻璃上的划痕,缺陷,污垢和碎片表面可以与样品一起成像。

聚光镜和目标棱镜

如图3所示,DIC聚光棱镜通常安装在一个旋转式转台冷凝器中,该冷凝器用作分束器以产生对入射偏振光波前的角度剪切,该冷却器设计用于容纳至少三个单独的棱镜。转塔规格和配置根据制造商,但他们通常包含四到八个辅助组件的插槽,包括Wollaston或Nomarski棱镜,相位对比圆环或暗场光圈。图3所示的冷凝器转台包含七个开口,其中三个充满相位对比环,三个充满DIC棱镜。开槽用于明场观察。

每个聚光器DIC棱镜(也称为补偿器辅助棱镜)必须与窄范围的客观数值孔径专门匹配,因此特定棱镜可能只适用于一个或两个物镜(例如,10x和20x)。因此,必须使用三到五个聚光棱镜来匹配10x和100x之间的整个物镜放大范围。一些制造商根据特定目标调整每个聚光棱镜,因此需要多达7个聚光棱镜来跨越具有不同数值孔径的干燥和油浸物镜的整个范围。

冷凝器DIC棱镜插件采用阳极氧化圆形铝板制成,具有组合棱镜(通常为圆形),用光学胶粘剂固定在精确的方向上。DIC棱镜楔块非常薄且切割紧密,以确保角度剪切值与客观数值孔径所需的匹配。抛光板必须小心处理,以避免指纹,油污,灰尘和碎屑污染。每个棱镜框包含一个槽或销,与冷凝器转台中的相应配合器配合,以便确定和确保冷凝器棱镜相对于物镜棱镜和偏振器(和分析器)轴的对准。

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物镜和分析仪之间放置的是第二个Nomarski复合棱镜,用于重新组合由聚光棱镜剪切的波前(图1,4和5)。这个棱镜通常被称为目标主体DIC棱镜可以与特定的聚光棱镜匹配,或者单个物镜棱镜可以用来重新组合具有由所有聚光棱镜表示的剪切角谱的波阵面。大多数显微镜制造商配置他们的DIC显微镜采用一个单一的目标Nomarski棱镜,它安装在一个矩形框架,滑入鼻甲(见图4)。为了将偏差延迟引入DIC光学系统,目标棱镜骑在滑动支架上,滑动支架可借助于千分尺控制旋钮在显微镜光轴上来回移动。

目的DIC棱镜设计用于通过整个显微镜光轴上的平移来引入偏置延迟,并制成长轴与棱镜剪切方向相对应的矩形(图4(b))。在正确对准的DIC显微镜中,聚光棱镜通过聚光镜和物镜系统的组合作用成像到物镜棱镜上。结果,由聚光棱镜产生的波前剪切在沿着两个棱镜的表面的每个点(它们彼此相反)精确匹配。沿着剪切轴转换任一棱镜会产生波前失配(偏移延迟),这反过来会引起在整个显微镜光圈内均匀的光程差。

图4中示出了来自不同制造商的几种客观棱镜滑块设计。所有复合棱镜都被安放在矩形框架中,并且平移控制旋钮位于框架的末端。采用控制旋钮将棱镜位置沿剪切轴横向移动(图4(b)),以便将偏差延迟(或净波前光程差)引入微分干涉对比度光学系统。设计用于反射光DIC显微镜的Nomarski棱镜滑块还包含第二个控制旋钮(图4(c)和4(d)),可在整个物镜放大倍率和数值孔径范围内调整棱镜高度以匹配不同的后焦平面位置。当显微镜在另一个成像模式下操作时,

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在用DSénarmont补偿器设计引入偏差延迟的DIC显微镜中,客观Nomarski棱镜通过固定安装座固定在物镜上方的鼻托上(图5(c))。使用deSénarmont补偿器的显微镜对于每个物镜都需要一个单独的物镜棱镜,但通常可以将相同的聚光器Nomarski棱镜用于两个或更多个物镜。通过将框架从显微镜鼻梁上滑开,可以轻松地从光路中移除固定的物镜棱镜安装座(图5(c))。

图5(a)示出了用于deSénarmont微分干涉对比的典型偏振器和四分之一波长延迟板配置。该单元安装在显微镜基座上的视场光阑调节旋钮上,并在对准延迟板光轴和偏振器传输方位角后,用锁定固定螺丝将其固定到旋钮上。偏光镜轴标记在deSénarmont补偿器单元的前部,刻度线可以使操作员定性确定偏光镜旋转时引入系统的偏差延迟量。锁定旋钮可用于相对于四分之一波长板保持偏光器不动。对于明场观察或没有DIC的增强对比技术,

用于deSénarmontDIC补偿的另一种技术是将四分之一波长补偿板放置在目标Nomarski棱镜和分析仪之间的光学系统中。在这种情况下,或者在聚光棱镜下采用标准线性偏振器,或者图5(a)中所示的deSénarmont补偿器设置为偏振器轴平行于延迟板快轴(仅线性偏振光从补偿器出射)并垂直于分析仪。图5(b)显示了一个用于在物镜棱镜后引入deSénarmontDIC补偿的中间管。在这种情况下,通过旋转分析仪而不是偏振器来将偏差延迟引入光学系统。

图5(b)中所示的中间管配备了用于观察物镜后焦面的Bertrand透镜,也有一个DIN标准插槽,能够容纳各种延迟板,包括deSénarmont补偿器(如图所示)。分析仪可以通过精密分度游标机制旋转,使操作员能够定量确定引入DIC光学系统的偏差迟滞水平。使用deSénarmont补偿器,可以以0.15纳米的精度轻松测量介于二十分之一至全波长范围内的偏置延迟值。另外,伯特兰透镜可以通过拇指轮方便地插入光路中,以便观察物镜后焦平面发生的事件。

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在DIC显微镜中,对比度是样本取向的函数,遇到的各种几何形状通常需要重新定位样本以最大化对比效果以观察目标结构。使用标准的矩形机械平台来观察DIC样本受到这些组件表现出的有限范围的旋转运动的阻碍,尽管x - y翻译机制减轻了仔细检查显微镜载片全部内容的负担。为了使样品容易旋转和操纵以呈现最佳的方位对比度,建议对DIC显微镜使用类似于图6(a)所示的圆形旋转台。圆形台使样品旋转360度,这对于在DIC中显示极端方位对比效应的延伸线性样品(例如硅藻或丝状结构)通常是必需的。观察期间标本的平移通过使用直接附着在圆形平台上的渐变机械舞台附件(图6(b))并牢固夹住显微镜载玻片。舞台应该沿显微镜光轴居中,

设计用于微分干涉对比度的物镜必须没有应力或双折射遮挡,使光线去极化并导致图像退化。过去,显微镜专家仅限于用于偏振光观察的无应变消色差和萤石物镜,但是具有较高校正因子的现代物镜现在可用于DIC显微镜。全面通用目标,这些先进的镜头系统通常可用于组合DIC,荧光,相衬和明场显微镜,而无需改变目标。此外,新设计的复消色差物镜具有足够的无应变,可用于偏振光和差分干涉对比观察,在较高放大倍数下显着改善图像质量和分辨率

微分干涉对比显微镜对准

在尝试配置显微镜进行差分干涉对比观察之前,请检查仪器以确定是否存在所有必要的组件,并且没有绒毛,灰尘和碎屑。包含应力信号的物镜和聚光镜元件可能会降低DIC中的图像,脏透镜表面,划痕和污染光路中的异物也会降级。正确对准显微镜对获得最佳结果和生成显示伪三维和阴影效果的图像至关重要。以下步骤中列出的许多步骤只有在首次对准DIC显微镜时才需要,并且不需要重复进行日常观察。每次使用显微镜进行DIC检查时应采取其他步骤。

初步的显微镜检查 - 仔细检查显微镜以确保安装了所有必需的DIC组件,或者在需要时提供并准备好使用。拆下冷凝器,拆卸转台,并检查Nomarski或Wollaston棱镜的状况。这些复合棱镜的表面应该清洁,没有灰尘和碎屑。由于它们安装在冷凝器转盘内,DIC聚光棱镜几乎不会被指纹污染,但灰尘和棉绒很容易流入转盘并落在其中一个平坦的石英表面上。要清洁受污染的棱镜表面,请使用橡胶气球除去松散的纤维和灰尘,和/或用镜头纸或湿软棉轻轻擦拭表面。小心不要划伤表面。应该对客观棱镜给予同样的治疗,聚光镜和物镜外部透镜元件,显微镜目镜透镜以及显微镜基座(或连接到倒置显微镜柱)的视场光阑端口处的场镜。确保关键部件清洁后,重新组装显微镜,安装偏光镜和分析仪,然后对光学系统进行科勒照明

安装偏光器和分析仪 - 拆下显微镜(冷凝器,DIC棱镜和至少一个物镜),将偏振器和分析仪分别安装在冷凝器下方和物镜上方的位置。以类似于偏振光显微镜的方式,偏振器和分析器被定位成使得它们的透射方位彼此以90度角(垂直)相交。安装在光源和聚光器之间的偏振器通常沿东西方向定向,或者在面对显微镜时从左向右定向。在某些情况下,偏振片和分析仪的位置都是由它们在安装框架中的固定位置预先确定的,并且这些组件只能以单个方向插入显微镜光路中。通常情况下,偏振器支架上的标记指示传输方向,但是一些显微镜配备有角度渐变的旋转偏振器支架(图2)。分析器也可以用分级旋钮旋转,和/或可以包含指示传输轴的标记。

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当偏振器和分析仪交叉时(透射轴以90度角取向),当通过目镜观察时,视场显得非常暗。这种情况被称为最大灭绝如果大量光线通过显微镜,并且视场不是黑色(或几乎黑色),请检查以确保偏振器和分析仪交叉。穿过偏光镜后,插入聚光镜和物镜,但不要安装物镜Nomarski棱镜滑块(或固定支架)。将聚光镜转盘旋转至明场位置(缺少相位板或DIC棱镜的插槽)。视场应保持黑暗,但如果这些组件(聚光镜或物镜)中的任何一个包含应变透镜元件,则可能会有一些光线通过。在进入下一步之前,从光学组件(偏振器或分析仪)上取下一个偏振元件。

建立科勒照明 - 在进行DIC配置之前(安装偏振片后),应使用标准Köhler技术将显微镜光学系统对准明场标本观察。在正确配置后,光源的图像(通常是钨卤灯)应通过安放在灯箱内的收集器透镜或沿显微镜框架基座内的光学系统投射到聚光器孔径光阑平面上。同时,聚光透镜系统还将视场光阑的图像投影到样本共轭平面(在显微镜阶段)。在灯丝居中之后(大多数现代灯箱包含一个预先居中的灯),0B位置)。使用10倍物镜将光阑调焦,叠加在聚焦标本上,然后打开虹膜叶片,直到在视场外围边缘只有一小部分光阑可见。对每个使用的物镜采取类似的步骤,通过调整场和孔径光阑,确保显微镜正确配置科勒照明的每个物镜。在DIC日常观察过程中,应定期检查显微镜以确保科勒照明得以维持。

检查物镜后孔 - 配置科勒照明显微镜后,插入偏光镜和分析仪,用相位望远镜或Bertrand透镜(锥光观察模式)检查物镜后焦平面。如果偏光镜和分析仪正确定位并且显微镜完全对准,则物镜光圈中将出现一个消光十字,如图7(a)所示。消光十字的臂应垂直和水平取向,光圈四个角上出现少量光线(图7(a))。影响消光十字的完整性的交叉或高度双折射区域中的亮点是应变光学的一个指标。此外,位于共轭孔径焦平面(聚光镜或物镜)附近的灰尘和绒毛颗粒在物镜后孔处观看时会显得很亮。如果存在双折射光斑,请检查另一个无应变物镜,以确定第一物镜或聚光透镜系统是否拉紧。在进行下一步之前,清除物镜表面或聚光镜表面上的污染灰尘,并更换应变光学元件(如果可能的话)。

目标DIC棱镜对准 - 通过插入滑块(图4)或限定在固定底座上的棱镜(用于使用deSénarmont偏置延迟的系统;参见图5)来安装目标棱镜。一旦棱镜就位后,再次用相位望远镜或伯特兰透镜检查物镜后焦平面。视场现在应该显得非常亮,但没有特征,单个黑色干涉条纹沿着剪切轴以45度角(参见图7(b))延伸穿过孔径直径根据显微镜是直立的还是倒置的,干涉条纹将以东北 - 西南(直立)或西北 - 东南(逆)方向穿过物镜后孔。在任何一种情况下,干涉条纹都应该有明确的规定,如图7(b)所示,并且位于孔径的中心。

在某些DIC显微镜设计中,客观棱镜是固定的(deSénarmont补偿),而在另一些DIC显微镜设计中,棱镜可以通过滑块框架中的定位螺丝机构在光轴上来回转换。在后一种情况下,在通过望远镜或伯特兰镜头观察物镜后焦平面的同时缓慢旋转调节旋钮。当旋钮旋转时,干涉条纹应远离其中心位置移动至明亮后孔的上半部分或下半部分。或者,在deSénarmont补偿器中转动偏光器也会产生相同的效果。

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聚光DIC棱镜对准 - 从光学组件中取出目标棱镜,并通过旋转聚光镜转台将最低光圈聚光棱镜(用于10倍物镜)摆动到位。适当的位置通常由转台上的红色或白色10设置(或类似的代码,例如L)标记)。重新聚焦相位望远镜或伯特兰透镜,观察物镜后焦平面出现的干涉条纹。再次,一个单一的边缘应该存在与棱镜产生的边缘相同的方向(东北 - 西南方为直立显微镜,或者西北 - 东南方向为倒置显微镜)。聚光镜和物镜棱镜的干涉条纹应该几乎相同,并且应该沿着剪切轴具有相同的方向。

为了清晰观察使用专为油浸设计的高数值孔径聚光器的聚光棱镜干涉条纹,可能需要使用摆动镜头控制杆移除前置镜头组件。如果物镜孔中出现的条纹未正确定位,可能需要调整聚光镜棱镜的方向或对齐。在大多数情况下,聚光镜棱镜安装在带有缺口或销钉(或锁定螺钉)的保护性圆形铝框架(图3)中,以确保冷凝器转盘内的正确定位。偶尔会有一个聚光棱镜被迫进入转台而没有正确对准,这在检查干涉条纹时会很明显。如果聚光棱镜看起来不对齐,

标本观察 - 将显微镜对准科勒照明,偏光镜和分析仪交叉,并安装两个棱镜(物镜和聚光镜),在镜台上放置一块薄的透明悬挂标本(如颊粘膜上皮细胞制备物)。调整显微镜以获得最大消光,并在通过正视模式下的目镜(无伯特兰透镜或相位望远镜)观察过程时聚焦试样。在视场中观察到的图像应该显得非常暗灰色,几乎是黑色,在最大消光处,在具有明确定义的厚度或折射率梯度的区域(例如细胞膜和细胞核;参见图8(b))中具有明亮高光。具有高折射率的球形样品(例如浸没油滴)甚至可以用作微小的镜片,

在观察聚焦的样本图像时,使用滑块旋钮转换目标DIC棱镜或在装备deSénarmont补偿装置的显微镜中旋转偏振器(或分析仪)。这种行为被称为引入偏差延迟,并且将沿着剪切轴平移样本的干涉条纹,并且对样本外观产生相应的变化。向一个方向移动棱镜(正偏置)将减轻一个边缘处的标本特征,同时使相反边缘上的相同特征变暗并同时减轻背景(参见图8(a))。一般来说,试样呈假三维外观,阴影效应与剪切轴方向相同。将棱镜移动到显微镜光轴的另一侧(负偏压)会使光亮和黑暗的样品区域反转(比较图8(a)和图8(c))。

在所有DIC组件正确安装并对齐的情况下,在最大消光度下,物镜后光圈呈现深灰色(几乎为黑色),并且在用相位望远镜或Bertrand透镜观察时,其相对均匀(图7(c))。在大多数情况下,后孔的中心区域呈黑色,而周边四个象限出现一些光线。消光十字通常看起来应该与单独使用正交偏光镜观察到的十分相似,但通常会更暗,并且覆盖物镜后孔的较大区域。围绕周边的明亮区域(图7(c))是由于聚光器和物镜中偏振器和透镜元件表面处的光部分消偏振而产生的伪像。

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通过掩蔽物镜后孔径中消光十字周边的明亮区域,可以显着改善微分干涉对比度图像。这可以通过减小聚光器孔径光阑的尺寸来消除亮边。一般情况下,客观的后孔尺寸应该减小到电容器光阑约全光阑的75%或80%。当光学系统完全对准时,消光十字直立出现(见图7),并且可以观察到由两个宽干涉条纹组成,每个干涉条纹均以直角成形并且在物镜后孔径的中心会聚(条纹也可以在低质量显微镜中以正视模式可视化)。

在某些显微镜上,可以调整聚光镜和物镜棱镜的位置以产生更均匀的条纹图案,从而导致光圈的中心区域显得更暗且更均匀。完成此任务是为了松开和旋转(或升高或降低)聚光棱镜,或者通过将偏振器和分析仪不交叉几度。偶尔显微镜包含固定螺丝,可以调整聚光镜和物镜棱镜,但如此配备的机型正变得罕见。作为显微镜对准的最后检查,调整聚光镜聚焦旋钮,同时检查物镜后光圈的消光图案,以确定是否可以改善。

通过平移物镜棱镜或以deSénarmont配置旋转偏振器来调整偏差延迟,可显着改善图像外观(超过在最大消光时观察到的图像外观)并增加对比度。该操作对于微分干涉对比中的样品成像是必不可少的,并且代表了显微镜光学组件调节的最后一步。在许多情况下,当观察DIC图像时,整个视场出现梯度光。除了在样品的相对边缘存在明暗强度以外,还会出现这种情况,这是由于光学系统产生的宽而不明显的场边缘伪影。具有良好匹配光学元件的显微镜使场条纹的尺寸最大化,它可以变得如此广泛和均匀分布,整个领域呈现出统一的中灰色。然而,在大多数情况下,边缘的一些证据仍然存在,并且视场呈现出从一个外围边缘到另一个边缘的光强度的浅梯度(中等至较浅或较深的灰度)。这种伪影是特定光学配置中固有的,在观察和采集DIC样本图像时应该忽略。

DIC显微镜中的补偿器

通过在DIC显微镜的光学路径中引入延迟板(或补偿器),也可以增加样品对比度。通常,在目标棱镜和分析仪之间的中间管中插入一个全波(也称为一补偿器)板,尽管该板也可以位于偏振器之后但在聚光棱镜之前。这些板在绿色区域(通常接近550纳米)处呈现整个波长的指定值的延迟水平,并且导致样品显示沿折射率和厚度梯度的黄色和蓝色牛顿干涉色。由于从白光中减去绿色波长,背景呈现洋红色。

在deSénarmont或标准(可转换)Nomarski棱镜DIC显微镜配置中,当客观棱镜的消光干涉条纹位于光路中心时,会出现类似于图7(b)所示的图案物镜后焦平面(假设聚光棱镜从光路上移除)。如果在物镜棱镜和分析仪之间放置一个全波延迟板,则图9(a)所示的显示牛顿干涉色光谱的干涉图出现在物镜后焦平面上。从光路上取下物镜棱镜并插入一个聚光棱镜产生图9(c)所示的图案。

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翻译目标Nomarski棱镜或旋转偏振片在deSénarmont补偿器配置中将改变图9(b)所示的牛顿干涉图样颜色。引入负偏差会将牛顿颜色转换为减色值(黄色),而将棱镜转换为正偏差值会导致颜色相加(蓝色)。由样品梯度产生的颜色可以与Michel-Levy参考图相比较以确定光程差的大小。

DIC显微镜配置错误

微分干涉显微镜正确配置后,所得图像通过似乎源自高度倾斜角度的阴影效果(见图10(a))显示伪三维性的真实性。但是,即使轻微的对齐误差也会导致细微的标本细节恶化,并且配置中的严重错误可能会导致造成图像无用的对比度急剧下降。DIC显微镜配置中最常见的错误是由于没有交叉的偏振器,目标和聚光镜棱镜之间的不匹配,缺少聚光器DIC棱镜或不正确设置聚光镜光圈孔径。其他问题可能会出现,特别是如果冷凝器和/或物镜不是无应变的,

先前在显微镜对准部分中讨论了确保偏振器交叉并且以正确的方向定位。有时候,偏光镜或分析仪可能会因拇指轮刷或不小心使用仪器而意外旋转离开位置。因此,总体样本对比度降低,但许多功能常常保持可见。这种类型的错误可以通过使用固定偏振器和分析器或通过确保锁定旋钮设置为暂停偏振器旋转来消除。大多数安装在旋转底座上的偏振片包含指示传输方位位置的标记。在开始DIC观察之前,仔细检查偏振器和分析仪的方向,以避免这些组件发生错误。

客观和聚光棱镜之间的意外不匹配是微分干涉对比显微镜中另一个常见的误差来源。由于不同棱镜之间的剪切角差异不一致,所得到的图像显示出极差的对比度(见图10(c)),无法通过平移目标棱镜或在德塞纳蒙补偿显微镜中旋转偏振片来校正。冷凝器转塔通常标有代码,用于识别放置在光路中的棱镜,检查外部代码顺序以确保冷凝器棱镜位于正确的槽内有助于避免这种类型的误差。在物镜筒上应该与使用中的聚光棱镜的代码相匹配。一般来说,当放大率改变时会发生棱镜不匹配,但是不会旋转聚光镜转盘以将匹配棱镜插入光路中。有时候,冷凝器或冷凝器转盘可能会丢失一个聚光镜棱镜,使其旋转到包含棱镜的位置(例如,明场位置;请参见图3)。结果是与图10(c)中所示的图像类似的图像,其缺乏对比度并且不显示利用微分干涉对比度可获得的高分辨率。

通常采用聚光镜虹膜光圈来调整景深和对目镜中观察到的图像或数字记录和胶片记录的对比度。在微分干涉对比显微镜中,宽光圈尺寸对于需要浅景深的光学切片实验很有用,但高分辨率也是必要的。通常,通过使用较小孔径所提供的最大对比度之间的折衷通过消除位于远离焦平面的干涉标本特征来抵消。如果聚光器孔径未充分打开(大约为物镜孔径的四分之三到四分之五),衍射伪影会遮蔽重要的样品细节并严重降低图像外观(图10(b))。一般来说,

当使用浸入水中的厚标本时,或者玻璃显微镜载玻片,培养皿或盖玻片太厚时,由于球差可能会发生额外的误差。这些错误表现为图像没有清晰聚焦,缺乏DIC图像特征的阴影浮雕。通常可以调整高放大率干物镜上的校正环以校正球差,但过厚的样品必须用更薄的部分替换。当检查培养细胞时,不要使用DIC光学系统和由注塑聚合物制成的培养容器。这些材料显示应力双折射并会产生混乱的图像。相反,使用专门为DIC显微镜设计的玻璃容器,可以从几家制造商那里购买。一般来说,

DIC显微镜的照明源

在较低的放大倍数下(10倍至40倍),50瓦石英卤素灯可提供足够的光线,以便在DIC中进行令人满意的观察和记录图像。但是,在最高放大倍数(60x和100x)下,建议至少使用100瓦钨卤素光源。光源所需的照明强度取决于偏振器和分析仪的透射百分比,许多老式的DIC显微镜配备有透射率低(20%或更低)的偏振元件。然而,后来的模型显微镜通常配备高透射率偏振片(大于30%),这使得更高的光通量密度能够通过光学系统,为最高放大倍数下的观察和成像提供足够的光线。

虽然粗糙的结构细节,如细胞边缘和较大的细胞内成分(细胞核)可以用高强度卤化钨灯很容易地观察到,但为了观察最好的结构细节,具有窄带宽的非常强烈的照明是必不可少的。汞弧放电灯在546纳米(绿色)的可见光谱中心部分具有高能量峰值,可以通过以546纳米为中心的窄带宽(10纳米)干涉滤光片进一步细化。另外,可以使用光扰码器来增强窄带宽照度以实现尽可能高的分辨率。请注意,无论光源如何,物镜光圈应完全照亮,以获得最佳效果。

结论

无论目标放大率和分辨率如何,差分干涉对比度显微镜中光学元件的正确位置和方向对于最佳性能至关重要。即使单个组件调整不当也会导致严重的图像质量下降,影响仪器的阴影效果和分辨率。DIC显微镜中的两个复合棱镜和它们相关的偏振器是镜像对。通过初始偏光镜和聚光棱镜的光波成像到物镜棱镜和分析仪上以产生最终图像。为了使DIC正常工作,所有这四个组件必须处于正确的方向。对比度是通过改变物镜棱镜的横向位置产生的,或者通过旋转deSénarmont补偿工具中的偏光片来实现。以这种方式,波前之间的光程差增大或减小以在样本中产生对比度。

应该指出的是,DIC中的对比度是样本光程长度的梯度的函数,当显微镜被适当地调整时,它们呈现伪三维浮雕。因为对比度是由折射率波动和/或厚度变化的组合引起的,所以使用该技术观察到的表观梯度可以对应于样本形貌的实际变化,或者可以是例如局部蛋白质浓度梯度的函数。只有与样本相关的结构特性的独立知识才能帮助确定DIC显微镜中对比效应的绝对性质。

另外,即使确定阴影效应可以真正归因于样本中的高度变化,DIC中也没有固有的机制来指出哪些特征代表了目标棱镜的特定位置处的高原或低谷。该问题的定性解决方案是定位已知的样品特征,例如玻璃上的划痕,并观察特征如何在目标棱镜在光轴上平移时如何响应偏差延迟。具有相似响应的积分标本特征将是谷底或平台,而具有相反响应的积分将具有相反的方向。

当用微分干涉对比检查未知样本时,显微镜专家应该警惕在边缘产生的干涉色,这些色彩通常没有特征,并且取决于方向,呈现非常浅或深的颜色。干涉色的存在表明样品可能是双折射的,因此不适合DIC观察。这个事实可以通过在正交偏振照明下检查样品来证实,其中客观和聚光DIC棱镜都从光路中移除。

在微分干涉对比显微镜上施加的限制是执行该技术所需的昂贵的双折射Nomarski或Wollaston棱镜。这些成分比相差显微镜霍夫曼调制对比显微镜所需要的要昂贵得多,这可以作为替代技术,特别是当观察塑料容器中的活细胞时。另外,当使用相差来代替DIC时,非常薄或散布的样本通常会产生更好的图像,具有更多的对比度。较旧的复消色差物镜可能不适用于DIC观察,因为物镜本身可能会显着影响偏振光。在购买与DIC光学元件配合使用的高质量复消色差物镜之前,显微镜专家应与制造商协商。


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