奥林巴斯微分干涉显微镜/DIC显微镜介绍

2019-06-19 16:31:23 Pooher Inc. 123

20世纪50年代中期,一位法国光学理论家Georges Nomarski修改了沃拉斯顿棱镜,用于检测样品中的光学梯度并将其转换为强度差异。今天有这种设计的几种实现,统称为差分干涉对比(DIC)。生活或染色的标本,在明视野照明下经常产生不良影像,通过光学而不是化学手段清晰可见。

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在透射光DIC中,来自灯的光以类似于偏振光显微镜的方式穿过位于台下聚光器下方的偏振器。接下来在光路中(但仍在聚光镜下方)是一种改进的沃拉斯顿棱镜,它将偏振光的入射光束分成两个光束,光束方向不同。沃拉斯顿棱镜由两个石英楔组合而成,从中出射的光线相互之间以90度的角度振动,并有轻微的路径差异。对于不同放大倍数的每个目标,需要不同的沃拉斯顿棱镜。沃拉斯顿棱镜通常装载到冷凝器上的旋转转台上,这使得显微镜专家可以在改变放大倍率时将适当的棱镜旋转到光路中。

仅在垂直于光束传播方向的一个方向(东西)振动的平面偏振光进入分束改进的沃拉斯顿棱镜并被分成彼此垂直振动的两条光线。这两条光线靠近,但方向稍有不同(参见图2)。这些光线在冷凝器的前焦面相交,它们在那里平行并且极其靠近,并且有微小的路径差异,但它们彼此垂直振动,因此不会造成干扰。光线之间的距离,称为剪切,非常微小,小于目标的分辨能力。

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分裂光束进入并穿过样品,在那里它们的波路径根据样品厚度,斜率和折射率的变化而变化。这些变化引起两个光束波路径的改变,这两个光束穿过任何靠近在一起的样本细节区域。当平行光束进入物镜时,它们聚焦在后焦平面上方,在那里它们进入第二个修改的沃拉斯顿棱镜,该棱镜将两束光束在棱镜本身之外的限定距离处结合起来。这消除了梁对之间的剪切和原始路径差异。由于已经穿过样本,所以平行光束的路径对于样本的不同区域而言具有不同的长度(光程差)。

为了使光束干涉,必须将不同光程长度的光束的振动引入同一平面和轴。这是通过将第二个偏振器(分析仪)放置在上沃拉斯顿光束组合棱镜的上方来完成的。然后光线向着目镜前进,在那里可以观察到强度和颜色的差异。设计的结果是细节的一侧显得很亮(或可能是彩色),而另一侧显得较暗(或另一种颜色)。这种阴影效应使样品具有伪三维外观。

在一些显微镜中,上面的改良沃拉斯顿棱镜与上面的分析仪结合在一起。上棱镜也可以布置成可以水平移动。这允许通过移动棱镜来改变光程差,为用户提供了改变背景和样本的亮度和颜色的机制。由于棱镜设计和布局,无论选择何种颜色,背景都是均匀的。

图像中显示的颜色和/或光强度效应尤其与折射率,样品厚度或两者的变化率有关。试样的取向可能对浮雕般的外观具有明显的影响,并且经常将试样旋转180度将山变成山谷或反之亦然。三维外观不是样品真实几何性质的表示,而是基于光学厚度的夸张。它不适合精确测量实际高度和深度。

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相差显微镜相比,DIC显微镜有许多优点。使用DIC,可以更充分地利用系统的数值孔径并提供光学染色(颜色)。DIC还可以使显微镜达到出色的分辨率使用全物镜光圈可以使显微镜专家将精力集中在厚试样的薄平面部分上,而不会混淆飞机上方或下方的图像。在DIC图像中缺少常见的相位差的令人讨厌的晕圈,并且可以使用合适的消色差和萤石物镜进行这项工作。

缺点是塑料组织培养皿和其他双折射标本在DIC中产生混乱的图像,因此建议组织培养工作使用霍夫曼调制对比度。此外,高质量的复消色差物镜现在被设计为适用于DIC。图3展示了飞蝇(传播DIC;图3(a))的口器部分和铁硅酸盐合金(反射DIC;图3(b))中的表面缺陷的透射和反射光DIC显微照片。两张显微照片均使用具有10倍物镜的延迟板制成。

DIC显微镜所需的设备包括偏振器,冷凝器下方的分束改良Wollaston棱镜,物镜上方的光束重组改造Wollaston棱镜以及位于该上棱镜上方的分析器。冷凝器下方需要各个棱镜(对于每个物镜)(图4)。对于上棱镜,单棱镜可以用于所有目标。上棱镜可以横向移动。

相对于聚光镜的前焦平面的下棱镜的放置距离和上棱镜与物镜的后焦平面的距离是非常关键的。制造商因此指定他们的哪些目标适用于他们特定的DIC设备。

DIC聚光镜包含四个或更多棱镜,明场开口和孔径光阑用于常规明场工作,和/或多个光环。光环和相位目标一起使显微镜专家能够快速比较相差和DIC图像。棱镜下方装有可旋转的偏光片。使用全物镜光圈可以聚焦在厚试样的薄平面部分上,而不会混淆来自正在聚焦的平面上方或下方的图像; 这被称为光学切片在光学显微镜中,较大的光圈也能产生更好的分辨率。

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图像中显示的颜色和/或光强度效应尤其与样本的细节或相邻区域中的折射率厚度或两者的变化率有关图像显示为三维。这种外观并不代表样品的真实几何特性,而是基于光学厚度的夸张,并不适合精确测量实际高度和深度。光学厚度是指由折射率或实际厚度的变化或这两个变量的某种组合引起的光路变化。

如上所述,在可动上棱镜的灰色设置下,三维性最为明显。标本的取向可以显着改善浮雕般的外观。有时180度标本的旋转将山丘变成山谷,反之亦然。因此图像的解释必须谨慎。通过赋予伪浮雕效果,一侧的较暗外观和另一侧的较亮外观大大提高了可视性。

要配置显微镜以进行DIC对比度增强,应考虑以下步骤:

  • 将DIC冷凝器放入显微镜的分液器冷凝器支架中,并将DIC沃拉斯顿棱镜安装到开槽喷嘴或每个物镜后面的插槽中。在明场(0)位置使用10倍物镜和聚光镜,在光路上使用偏振器,在台上放置样品,以便建立科勒照明将标本移出光路并取下其中一个目镜。

  • 将相位调焦望远镜插入目镜管中,在观察物镜的后焦平面时,旋转上棱镜的螺丝,直至看到物镜背面中央出现一条对角线的黑线。现在稍微旋转分极偏光镜,使黑线尽可能黑。这实际上是调整偏振器,使其与位于上棱镜上方的分析器交叉(以90度角)。确保聚光器孔径光圈打开到物镜后部镜头直径的2/3至4/5。

  • 取下聚焦望远镜并将常规目镜返回到眼管。旋转聚光镜转台,将合适的下棱镜带入光路; 这通常由炮塔上的红色或白色10设置标记将样本移回光路。现在您可以使用上部棱镜的旋钮将其来回翻转以获得所需的效果或颜色。您也可以旋转舞台改变标本的方向以改善效果。

  • 对每个使用的物镜采取类似的步骤,通过调整场和孔径光阑,确保显微镜正确配置科勒照明的每个物镜。

这些在DIC显微镜中有许多优点,特别是与相显微镜相比:

  • 可以更充分地利用系统的数值孔径,因为与相差显微镜不同,不存在用于限制孔径的亚平面环; 科勒照明正确使用。

  • 在阶段图像中可能会遇到混淆的晕圈。

  • 图像可以看到惊人的颜色(光学染色)和三维阴影般的外观。轮廓和细节的可见性大大提高,并且这些图像的显微照片在颜色和细节方面显着。

  • 如果制造商声明这些目标是为他们的设备设计的,则可以使用普通planachromatics或消色差(也适用于普通的明视野工作)。

DIC有几个缺点或限制:

  • 由于需要很多棱镜,DIC设备相当昂贵。

  • 诸如那些在许多晶体中发现的双折射标本可能不适合,因为它们对偏振光的影响。类似地,由塑料制成的样本载体,例如培养容器,培养皿等可能不适合。对于这样的标本,霍夫曼调制对比可能是更好的选择。

  • 对于非常薄或分散的样本,使用相差法可以获得更好的图像。

  • 复消色差物镜可能不适合,因为这些物镜本身可能会极大地影响偏振光。

再次,像许多对比增强技术一样,我们发现,在聚光镜的前焦平面和物镜的后焦平面处对光的操纵对通过目镜可视化的图像的外观具有显着影响。


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查看原始的英语文章:Brief Overview of DIC Microscopy


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