奥林巴斯显微镜:数值孔径和分辨率

2018-10-12 10:53:02 Pooher Inc. 594

显微镜物镜数值孔径是衡量其聚集光线并在固定的物距处分辨精细标本细节的能力。 如图1所示,成像光波穿过样品并以倒锥形进入物镜。该锥形光锥的纵向切片显示角度孔径,该值由物镜的焦距确定。

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角度μ是角孔径(A)的一半,并通过以下等式与数值孔径相关:


数值孔径(NA)= n(sinμ)

其中n是物镜的前透镜和样品盖玻片之间的成像介质的折射率,对于专用浸没油,其范围从空气1.00到1.51。 许多作者在数值孔径方程中将变量α代入μ。 从这个公式可以看出,当成像介质是空气时(折射率n = 1.0),数值孔径只取决于最大值为90°的角度μ。 因此,角度μ的正弦值最大值为1.0(sin(90°)= 1),这是以空气作为成像介质的镜头的理论最大数值孔径(使用“干”显微镜物镜)。

然而,实际上,用干物镜实现高于0.95的数值孔径值是困难的。 图2展示了一系列由不同焦距和数值孔径物镜衍生而来的光锥。 随着光锥的变化,角度μ从图2(a)中的7°增加到图2(c)中的60°,从而导致数值孔径从0.12增加到0.87,接近空气成像时的极限 中。

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通过检查数值孔径方程,显然折射率是实现大于1.0的数值孔径的限制因素。因此,为了获得更高的工作数值孔径,必须增加物镜的前透镜和试样之间介质的折射率。现在可以使用显微镜物镜,可以在替代介质(如水(折射率= 1.33),甘油(折射率= 1.47)和浸没油(折射率= 1.51))中进行成像。应该谨慎使用这些物镜,以防止当物体与不同的浸泡介质一起使用时产生的不希望的假象。我们建议显微镜专家们不要使用为甘油或水浸油而设计的物镜,尽管最近已经推出了几个可与多种介质配合使用的新物镜。如果有任何疑问,您应该咨询制造商。


在60x和100x(及更高)的放大倍率范围内的大多数物镜设计用于浸油。通过检查上面的数值孔径方程,我们发现用浸没油获得的最高理论数值孔径为1.51(当sin(μ)= 1时)。但实际上,大多数油浸物镜的最大数值孔径为1.4,最常见的数值孔径范围为1.0至1.35。

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物镜的数值孔径也在一定程度上取决于光学像差的校正量。 如下表1所示,经过高度校正的物镜往往具有相应放大率的更大的数值孔径。 如果我们以一系列典型的10倍物镜为例,我们可以看到,对于平场校正的平场物镜,数值孔径增加对应于色差和球差的校正:平场消色差,N.A. = 0.25; 平场萤石,N.A. = 0.30; 并平场复消色差,N.A. = 0.45。

Objective Numerical Apertures
MagnificationPlan
Achromat
(NA)
Plan
Fluorite
(NA)
Plan
Apochromat
(NA)
0.5x0.025n/an/a
1x0.04n/an/a
2x0.06n/a0.10
4x0.100.130.20
10x0.250.300.45
20x0.400.500.75
40x0.650.750.95
40x (oil)n/a1.301.00
60x0.750.850.95
60x (oil)n/an/a1.40
100x (oil)1.251.301.40
150xn/an/a0.90
Table 1

在一系列具有类似放大倍数的物镜中,增加数值孔径的特性在整个放大倍数范围内都是真实的,如表1所示。大多数制造商努力确保其物镜具有最高的校正和数值孔径,即可能为每一类物镜。


显微镜物镜的分辨率被定义为样品上两点之间的最小距离,仍然可以区分为两个独立的实体。分辨率对于显微镜来说是一种有些主观的价值,因为在高放大倍数下,图像可能会显得不清晰,但仍然会被解析为物镜的最大能力。数值孔径决定了物镜的分辨能力,但显微镜系统的总分辨率也取决于分镜面聚光镜的数值孔径。整个系统的数值孔径越高,分辨率越好。


显微镜光学系统的正确对准对于确保最高分辨率也极为重要。底座聚光镜必须与物镜的孔径数值孔径和孔径光阑光阑相匹配,以便形成精确的光锥。用于成像样品的光的波长谱也是决定因素。与较长的波长相比,较短的波长能够更详细地解析细节。有几个公式可以用来表达数值孔径,波长和分辨率之间的关系:

R = λ / 2NA
(1)
R = 0.61λ / NA
(2)
R = 1.22λ / (NA(obj) + NA(cond))
(3)

其中R是分辨率(两个物体之间的最小可分辨距离),NA等于数值孔径,λ等于波长,NA(obj)等于客观数值孔径,而NA(Cond)是聚光器数值孔径。注意公式(1)和(2)的乘法因子不同,对于公式(1)为0.5,对公式(2)为0.61。这些方程式基于许多因素(包括由光学物理学家进行的各种理论计算)来说明物镜和聚光镜的行为,不应被视为任何一种一般物理法则的绝对值。在某些情况下,如共聚焦和荧光显微镜,分辨率可能实际上超过了这三个方程中任何一个的限制。其他因素,如低样本对比度和不适当的照明可能会降低分辨率,并且通常会降低R的实际最大值(使用550 nm的中波长波长约为0.25μm)和数值孔径为实践中未实现1.35至1.40。表2通过客观放大和校正提供列表分辨率(R)和数值孔径(NA)。

Resolution and Numerical Aperture
by Objective Type
OBJECTIVE TYPE
Plan Achromat
Plan Fluorite
Plan Apochromat
Magnification
N.A
Resolution
(µm)
N.A
Resolution
(µm)
N.A
Resolution
(µm)
4x
0.10
2.75
0.13
2.12
0.20
1.375
10x
0.25
1.10
0.30
0.92
0.45
0.61
20x
0.40
0.69
0.50
0.55
0.75
0.37
40x
0.65
0.42
0.75
0.37
0.95
0.29
60x
0.75
0.37
0.85
0.32
0.95
0.29
100x
1.25
0.22
1.30
0.21
1.40
0.20
N.A. = Numerical Aperture
Table 2

当显微镜处于完全对准状态并且物镜与聚光镜电容器适当匹配时,我们可以将物镜的数值孔径代入方程(1)和(2),并且方程(3)减少到等式(2)。需要注意的一个重要事实是放大倍数并不是这些方程中的任何一个因素,因为只有数值孔径和照明光的波长决定了样本的分辨率。正如我们所提到的(并且可以在方程中看到),光的波长是显微镜分辨率的重要因素。波长越短,分辨率越高(R的值越低),反之亦然。光学显微镜的最大分辨能力是用近紫外光(最短的有效成像波长)实现的。接近紫外线后依次为蓝色,然后是绿色,最后是红色光能够解析标本细节。在大多数情况下,显微镜使用钨卤素灯泡产生的白光照亮样品。可见光谱集中在约550纳米处,绿光的主要波长(我们的眼睛对绿光最敏感)。正是这个波长被用来计算表2中的分辨率值。数值孔径值在这些方程中也很重要,更高的数值孔径也会产生更高的分辨率,如表2所示。光波长分辨率,固定数值孔径(0.95),列于表3。

Resolution versus Wavelength
Wavelength
(nanometers)
Resolution
(micrometers)
360.19
400.21
450.24
500.26
550.29
600.32
650.34
700.37
Table 3

当来自样本各点的光线穿过物镜并被重组为图像时,样本的各个点在图像中以小图案(而非点)出现,称为艾里图案。 这种现象是由于光线穿过样品中的微小部分和空间以及物镜的圆形后孔径时衍射或散射引起的。 艾里模式的中心最大值通常被称为艾里斑,它被定义为由艾里模式的第一个最小值所包围的区域,并包含84%的光能。 这些艾里磁盘由小的同心光和黑眼圈组成,如图3所示。该图显示艾里磁盘及其强度分布与间隔距离的函数关系。

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图3(a)示出假想的艾里斑,其基本上由包含由同心的第一,第二,第三等包围的中心最大值(通常称为零级最大值)的衍射图组成,强度分布。图3(b)说明了两个艾里磁盘及其在光学分辨率极限下的强度分布。在这部分图中,两个磁盘之间的间隔超过了他们的半径,并且它们是可以分辨的。两个艾里磁盘可以分解成不同实体的限制通常称为瑞利标准。图3(c)示出了两个艾里盘及其强度分布,其中零阶最大值之间的中心到中心距离小于这些最大值的宽度,并且这两个盘不能通过瑞利准则单独分辨。


艾里磁盘在形成图像时由物镜投影越小,样本的细节就越明显。更高矫正的物镜(萤石和复消色斑)产生的艾里斑小于物镜矫正率低的物镜。以类似的方式,具有更高数值孔径的物镜也能够产生更小的艾里磁盘。这是高数值孔径物镜和光学像差总校正能够区分试样细节的主要原因。

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图4说明了数值孔径对艾里磁盘尺寸的影响,该系列假设的物镜具有相同的焦距,但数值孔径不同。如图4(a)所示,Airy磁盘尺寸较小时,数值孔径较大。然而,随着物镜的数值孔径和光锥角度的增加,艾里斑的尺寸减小,如图4(b)和图4(c)所示。在目镜光阑水平处产生的图像实际上是艾里磁盘的马赛克,我们认为它是明暗的。在两个磁盘太靠近在一起使得它们的中心点重叠很多的情况下,由这些重叠磁盘表示的两个细节不会被分解或分离,因此看起来像一个,如上面图3所示。

在图像形成中理解的一个重要概念是物镜截取的衍射光线的性质。只有在捕捉到较高(第一,第二,第三等)阶衍射光线的情况下,干涉才能在物镜的中间像平面重新生成图像。当仅捕获零级光线时,几乎不可能重建样品的可识别图像。当第一阶光线被添加到第零阶光线时,图像变得更加连贯,但它仍然缺乏足够的细节。只有当高阶射线重新组合时,图像才能代表样本的真实结构。这是大数值孔径(和随后的较小艾里磁盘)需要用光学显微镜实现高分辨率图像的基础。


在日常的日常观察中,大多数显微镜专家不会试图用他们的设备获得最高分辨率的图像。只有在特殊情况下,如高倍放大的明场,荧光,DIC和共焦显微镜,我们力求达到显微镜的极限。在显微镜的大多数用途中,不需要使用高数值孔径的物镜,因为使用较小的数值孔径物镜可以很容易地解决样品的问题。这一点尤其重要,因为高数值孔径和高放大倍率伴随着非常浅的景深(这指的是恰好在正在检查的区域下面或正上方的区域中的良好焦点)和短的工作距离的缺点。因此,在分辨率不太重要,放大倍数可能较低的样品中,最好使用适度数值孔径的较低放大倍率物镜,以产生更多工作距离和更大景深的图像。


仔细定位底座聚光器孔径光阑对于控制数值孔径也很关键,并且不加区别地使用该光阑可能会导致图像质量下降(如在底座聚光器一节中讨论的那样)。其他因素,如对比度和照明效率,也是影响图像分辨率的关键因素。


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