奥林巴斯显微镜物镜:专门应用的物镜

2018-08-17 16:53:35 Pooher Inc. 564

也许多达90%的光学显微镜检查是利用标准消色差或平场消色差物镜进行的,这些消色差物镜是最便宜,最容易获得的,并且已经安装在世界各地的大型显微镜基础上。 大多数显微镜制造商还提供各种具有独特配置的物镜,旨在执行通常实验室显微镜不常见的特定功能。

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标准明视场物镜,经过不同程度的光学像差校正,是最常见的,对于用传统照明技术(如明场,暗场,倾斜和莱茵伯格)检查样本非常有用。这些方法中的一些涉及对亚平台聚光镜的改进,但仍然使用具有或不具有平场校正的标准消色差,萤石和/或复消色差物镜。其他更复杂的技术需要特定的物镜配置,这通常包括在后焦平面上或附近放置探测器。为了使问题复杂化,客观的后焦平面通常驻留在内部玻璃透镜元件的中心,这是显微镜专家不容易接触的区域。


设计用于相位对比,霍夫曼调制对比度和差分干涉对比度的物镜需要光学检测器的协助来修改发生在物镜后焦平面上的事件。这些物镜必须专门构造成将检测元件物理地放置在物镜体内的适当焦平面处。相位差物镜(如下所述)需要在后焦平面上插入包含中性密度材料和/或光波延迟器的相位板。另外,相位板必须与位于底下聚光镜中的匹配环形圈共轭放置。霍夫曼物镜还需要在物镜后焦平面内的调制板,该调焦板与聚光镜中的狭缝板共轭。微分干涉对比度物镜通常不需要修改(除了使用无应变光学元件),而是依靠战略性布置的Wollaston或Nomarski棱镜的作用来影响后焦平面上剪切光束之间的光程差。其他专门的物镜依赖于改进的光学元件,插入反射镜或倾斜反射器,可调节的孔,和/或可移动元件以执行独特的功能。有关这些物镜的具体要求的细节在本节的其余部分讨论。


相位对比度 - 这是一种将对比度引入半透明,未染色的标本(如生物组织培养中的微生物和细胞)的经典方法,生物学家在过去的50年中一直采用这种方法。相位对比操纵单个光线之间的相位关系,因为它们从样品发出并将其转化为显微镜工作者可以看到的振幅或亮度变化。如图1所示,需要一个特殊的物镜,在物镜的后焦平面附近安装一个黑色的圆环或凹槽(相位板),此外,聚光镜还必须改装特殊的环形开口适合于特定的放大和物镜。根据内部相位环的结构和中性密度,相位差对象被分成许多类别:

DL(暗光) - DL物镜在浅灰色背景上产生黑色图像轮廓。这些物镜旨在提供具有较大折射率差异的样本中最强的暗对比度。 DL相位差对象是用于检查细胞和其他半透明生物材料的最流行样式,特别适用于显微摄影和数字成像。

DLL(暗下对比度) - 与DL物镜类似,DLL系列允许在明场中获得更好的图像,并且常常用作显微镜系统中的“通用”物镜,该系统利用荧光,DIC,明场和暗场等多种照明模式。

ADL(变暗暗光) - 尼康最近推出的变迹相位对比ADL物镜在相位环的任一侧都包含一个二次中性密度环。辅助环的添加有助于减少通常与相差显微镜成像相关的不希望的“晕圈”效应。

DM(暗 - 中) - DM物镜在中等灰色背景上产生黑色图像轮廓。这些物镜被设计用于与具有小相位差的样品(如细纤维,颗粒和颗粒)进行高图像对比。

BM(明亮 - 中等) - 通常称为负相衬对比度,BM物镜在中等灰度背景下产生明亮的图像轮廓。 BM物镜非常适合肉眼检查细菌鞭毛,纤维蛋白束,微小球和血细胞计数。

为了使显微镜专家能够快速识别相衬对象,许多制造商在外筒上以绿色字母标出了重要规格,如放大倍率,数值孔径,管长校正等。这用于区分相位差对象与普通的明场,偏振,DIC和荧光物镜,它们使用替代颜色代码或标准黑色刻字。


微分干涉对比(DIC) - Nomarski微分干涉对比对未染色的样品也很有用,但对双折射样品不太有效,可用于金相和晶圆检测的反射光。 DIC物镜在内部不作修改,但是设计用于特殊放大倍率相关的改进Wollaston或Nomarski棱镜以生成高对比度图像。当棱镜从光路中移除时,这些物镜对于明场,暗场和其他技术也很有用。由于DIC显微镜采用偏振光,所以为此类应用设计的物镜应变必须最小化。过去,只有无应力消色差,平面反射镜和一些高性能萤石物镜适用于这项任务。然而,近来透镜设计和抗反射涂层的改进允许使用复消色差物镜进行DIC观察,显微摄影和数字成像。打算用于DIC棱镜的物镜桶通常刻有旨在与物镜耦合的特定棱镜(低,中,高或1,2,3等等)。

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霍夫曼调制对比度 - 霍夫曼调制对比度系统的物镜是通过检测光学梯度(或斜率)并将其转换为光强度的变化来提高未着色和活体材料的可见度和对比度。调制对比度物镜有一个独特的光学振幅空间滤波器,称为调制器,插入消色差或平场色物镜的后焦平面(见图2)(尽管也可以使用更高的校正因子)。该调制器具有三个不同中性密度的区域,透过物镜的光线的百分之一,十五或百分之一。与相衬物镜中的相位板不同,霍夫曼调制器的设计不会改变通过任何区域的光线的相位。当在调制对比光学器件下观察时,在普通的明场显微镜中基本上不可见的透明物体具有由样品中相梯度决定的明显的三维外观。霍夫曼物镜设计最近的创新已经产生了模型,可以使用物镜中的调制器来改变对比度方向。一旦调整后,对比度方向就会保持在一组匹配物镜的整个放大范围内。


红外显微镜 - 在电磁辐射光谱的红外区域中的光学显微镜通常用于研究在可见光谱中均匀透明或不透明的材料,但在700纳米以上波长区域具有显着的吸收或透射带。反射光是红外显微镜的首选技术,并且已经设计了几个专用的反射物镜来捕获来自不透明样品反射的红外光的图像。


虽然所有的显微镜物镜都会传输一定程度的红外线波长,但很少有人会在这个区域对像差进行校正,并且在从可见光到红外光的超越时,会出现明显的焦点偏移。大多数制造商提供减少数值孔径的专用物镜,旨在增加用红外光成像的样品的焦深。使用标准油时,油浸物体不能正常工作,目前红外显微镜可用的唯一合适的浸没液体是石蜡油。这种类型的显微镜主要关注的是使用传统成像技术捕获令人满意的显微照片的能力。目前,有几种胶片乳剂可用于对红外光谱作出响应,但电子探测器正迅速成为该波长范围内研究的首选成像设备。

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干涉显微镜 - 干涉测量法适用于显微镜标本的研究,它利用光线通过物体时产生的干涉,干涉参照光线,光线遵循不同的路径。在这些情况下,当两个光束之间的路径差被转换为强度波动时,反射光样本或透明样本的不透明表面被成像。各种各样的显微镜和物镜设计已经用于干涉显微镜,许多遵循迈克尔逊,马赫 - 曾德尔和Jamin干涉仪的基本原理。工业显微镜(反射和透射照明)的制造商通常会生产专门的物镜/显微镜组合,利用光学干涉现象来实现高精度测量。


偏振光 - 与大多数其他形式的显微镜不同,偏振光显微镜可以在构建物镜时使用最少的光学元件,获得最佳图像。确保透镜元件,光学胶合剂和抗反射涂层不含可能干扰样品双折射定量评估的应变和双折射材料,这一点很重要。复消色差物镜是大多数显微镜形式的选择,通常不用于偏振光调查,因为内部透镜元件数量众多,常常导致内部反射和应变。大多数制造商生产专门针对偏振光和差分干涉对比而优化的物镜,其中萤石级物镜最常用于这些目的。针对偏振光进行了优化的物镜通常会将镜筒的外部涂成黑色,并且规格以鲜红色字母标出(图3)。

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紫外荧光物镜 - 落射荧光应用需要高数值孔径物镜才能捕获微弱发射荧光样品的最大光量。当对单分子和其他低光荧光事件进行成像时,特异性标本荧光与固有背景荧光的比率成为首要考虑因素。在这些情况下,物镜内部的自发荧光和/或内部反射会干扰成像小结构和低荧光物镜。


荧光物镜采用石英和特殊玻璃,通过电磁辐射光谱的红外线区域从紫外线(低至340纳米)透过率高。这些物镜在自动荧光方面极低,以优化通过附着于样品的荧光团作为二次荧光发射的光通量。除了特殊的透镜元件外,紫外(UV)荧光物镜还使用专门的光学胶和抗反射涂层,设计用于在整个光谱范围内扩展荧光激发范围。对UV荧光物镜中的光学像差和数值孔径值的校正通常接近使用这些高级透镜产生的图像亮度和增强图像分辨率的复消色差分析仪(图4)。此外,这些物镜采用非荧光玻璃设计,可最大限度地减少内部透镜元件产生的自发荧光造成的伪影。高性能荧光物镜的主要缺点是许多不能对场曲进行校正,导致图像在整个视场中没有统一的焦点。虽然这个问题仅在成像弱荧光样品(特别是激光扫描共聚焦显微镜)时成为次要考虑因素,但当物镜被用于在诸如明场,暗场和微分干涉对比等传统照明技术下执行时,这成为主要问题。

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反射光物镜 - 设计用于防护玻璃的透射光物镜不适用于检查表面未被覆盖的反射光样本。取而代之的是,专门用于反射光显微镜检查的专用物镜被用于观察和成像没有玻璃盖的样品。今天,大多数反射光学显微镜的物镜都是无限校正的,可以在5倍到200倍的广泛放大倍率下使用。这些物镜是制造各种品质的色彩和球形校正,从简单的消色差到planachromats和planapochromats。大多数(但不是全部)设计为在物镜和样品之间的空间中与空气“干燥”使用。许多反射光物镜被设计为与通常情况下相比,样品的工作距离更长(见下文)。这些物镜在LWD(长工作距离),ULWD(超长工作距离)和ELWD(超长工作距离)的物镜桶上标记。


旨在用于反射暗视场照明的物镜具有特殊的结构,包括位于中心的透镜元件周围的360度空心腔(图5)。来自照明器的光线穿过物镜的外围,并从斜射线中的每个方位角照射到样品,形成一个空心的照明锥。这通常通过位于物镜中空腔底部的圆形镜或棱镜来完成。以这种方式,物镜用作两个同轴耦合的独立光学系统,使得外部系统用作“聚光镜”,而内部系统用作典型物镜。

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在反射光物镜中围绕透镜元件的中空套环的必要性要求物镜的直径明显大于普通明场物镜的直径。在大多数情况下,在反射光物镜中使用直径大于皇家显微镜学会(RMS)标准的鼻镜安装螺纹直径。这要求反射光暗场物镜具有较大螺纹尺寸的物镜,这通常称为BD或BF / DF螺纹尺寸。大多数制造商提供的物镜适配器可将标准RMS螺纹尺寸鼻托转换为BD螺纹尺寸,从而允许在反射光显微镜上使用这些物镜。应注意确保BD螺纹鼻梁上使用的物镜与显微镜的管长一致。


可变数值孔径物镜 - 具有异常高荧光量子产额和/或非常明亮的暗场标本的样本通常会诱发焦平面外部区域发出的光线产生的图像闪光。为了补偿这种伪影,制造商提供了高数值孔径物镜,配备了内部虹膜光圈,以增加显微摄影或数字成像过程中的图像对比度。打开或关闭光阑确定物镜后孔径的大小,从而产生介于0.5和物镜上限之间的可变数值孔径范围(使用消色差物镜时达到1.35-1.4;图6)。虽然虹膜光阑曾被广泛用于多种客观设计,但现代可变数值孔径物镜通常处于放大范围的高端(60x至150x)。

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超低放大率物镜 - 放大倍数低于4倍的物镜被认为放大倍率非常低(请参见图7),可能与所有显微镜光学系统不兼容。一般来说,科勒照明很难通过低放大倍数物镜来实现,这通常需要专门的匹配聚光镜来填充后部光圈以获得足够的照明。最近已经达到0.5倍的放大倍数,但是这些物镜需要特殊的管透镜和聚光镜,使得它们仅在它们所设计的显微镜上有用。


长工作距离(LWD) - 这些物镜旨在通过使用特殊光学元件来增加与传统物镜相比的工作距离。 LWD物镜最有用的应用是通过用于支撑细胞的厚壁容器的壁观察组织培养中的活细胞。这些物镜的其他用途是通过厚玻璃板(例如,在两个显微镜载玻片之间)对样品进行成像,或者在观察时必须对样品进行显微操作。反射光物镜也产生了很长的工作距离,用于检查通常体积太大而不能放入普通显微镜光学系统范围内的大型标本。


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查看原始的英语文章:Anatomy of the Microscope - Microscope Objectives

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