奥林巴斯显微镜物镜介绍

2018-10-12 10:53:02 Pooher Inc. 2216

显微镜物镜可能是光学显微镜最重要的组成部分,因为它们负责原始图像形成,并在确定显微镜能够产生的图像质量方面发挥核心作用。 物镜也有助于确定特定标本的放大倍数和在显微镜下观察细小标本细节的分辨率

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物镜是设计和组装光学显微镜中最困难的部件,并且是光从样品前进到像平面时遇到的第一个组件。物镜从它们的名称中得出它们的名称,它们是靠近的,与成像对象(标本)最接近的组件。

 

主要的显微镜制造商提供了广泛的客观设计,在广泛的照明条件下具有出色的光学特性,并为主要光学像差提供各种程度的校正。图1所示的物镜是250倍长的工作距离复消色差器,其中包含14个光学元件,这些光学元件粘合在一起形成三组透镜双合透镜,一个透镜三合透镜组和三个单独的内部单透镜透镜。该物镜还有一个半球形前透镜和一个弯月形第二透镜,它们同步工作以协助以最小的球面像差捕获高数值孔径的光线。虽然没有出现在这个物镜上,但许多类似设计的高倍率物镜都配备了弹簧式可伸缩鼻锥组件,该组件可保护前透镜元件和标本免受碰撞损坏。内部透镜元件经过精心定位并紧密包装在由物镜筒封装的管状黄铜外壳中。特定的物镜参数,例如数值孔径,放大率,光管长度,像差校正程度和其他重要特性被印在或刻在机筒的外部。尽管图1所示的物镜被设计成利用空气作为物镜前镜片和样品之间的成像介质,但其他物镜具有前镜片元件,可以将它们浸入水,甘油或专门的基于碳氢化合物的油中。

 

由众多内部玻璃透镜元件组成的现代物镜已经达到了高质量和高性能,对像差和平坦度的矫正程度决定了物镜的实用性和成本。用于制造物镜的施工技术和材料在过去的100年中有了很大的改进。今天,物镜在计算机辅助设计(CAD)系统的协助下进行设计,该系统采用具有高度特定折射率的均匀成分和质量的先进稀有玻璃配方。使用这些先进技术演示的增强性能使制造商能够生成色散非常低的物镜,并校正大部分普通光学伪影,如彗差,散光,几何失真,场曲,球面和色差。现在不仅显微镜的物镜在更广泛的领域中纠正了更多的像差,而且随着光透射率的大幅增加,图像闪光明显减少,产生明亮,锐利和清晰的图像。

 

物镜的三个关键设计特征决定了显微镜的最终分辨率极限。这些包括用于照射样品的光的波长,由物镜捕获的光锥的角度孔径,以及物镜前镜头和样品之间物体空间的折射率。衍射极限光学显微镜的分辨率可以描述为两个紧密间隔的样本点之间的最小可检测距离:

 

R =λ/ 2nsin(θ))

其中R是分离距离,λ是照射波长,n是成像介质折射率,并且θ是物镜角度孔径的一半。在检查方程时,分辨率与照明波长成正比变得明显。人眼对400700纳米之间的波长区域作出响应,这代表用于大多数显微镜观察的可见光谱。分辨率也取决于成像介质的折射率和客观角孔径。物镜设计用于在前部透镜和样品之间用空气或折射率较高的介质对样品成像。视场通常非常有限,物镜的前部透镜元件靠近必须与之光学接触的样品放置。当用浸没油代替空气作为成像介质时,获得约1.5倍的分辨率增益。

 

决定物镜分辨率的最后但可能最重要的因素是角孔径,其实际上限约为72度(正弦值为0.95)。与折射率结合使用时,产品:


N(SIN(θ))

被称为数值孔径(缩写为NA),并且为任何特定物镜提供分辨率的便利指示。数值孔径通常是选择显微镜物镜时要考虑的最重要的设计标准(除了光学校正)。对于使用专用浸油的高性能物镜,数值范围从0.1到非常低的放大倍数(1倍到4倍)到1.6倍。随着相同放大倍数的一系列物镜数值孔径值的增加,我们通常会观察到更大的聚光能力和分辨率的提高。显微镜专家应该仔细选择客观的放大倍数,以便在最好的情况下,将刚刚解决的细节放大到足以让人舒适地观看,而不是放大倍率妨碍观察精细的标本细节。

 

正如显微镜中照明的亮度由聚光镜的工作数值孔径的平方决定的,由物镜产生的图像的亮度由其数值孔径的平方决定。此外,客观放大倍率在决定图像亮度方面也起着重要作用,这与横向放大倍数的平方成反比。数值孔径/放大倍数的平方表示当与透射照明一起使用时物镜的聚光能力。由于高数值孔径物镜经常可以更好地校正像差,因此它们还可以收集更多光线,并产生更高亮度,更正确的高分辨率图像。应该注意的是,图像亮度随着放大率的增加而迅速下降。在光照水平是限制因素的情况下,选择具有最高数值孔径的物镜,但具有能够产生足够分辨率的最低放大倍数。

 

在大多数实验室显微镜上使用的最便宜(最普通)的物镜是消色差物镜。这些物镜在两个波长(分别为蓝色和红色;分别为约486和656纳米)的轴向色差上进行了校正,这些波长被带入一个共同的焦点。此外,消色差物镜的颜色为绿色(546纳米,参见表1)。消色差物镜的有限修正可能导致大量的伪影,当检查标本并用彩色显微镜和显微摄影成像时。如果在光谱的绿色区域中选择了对焦,则图像会出现红紫色晕圈(通常称为残余色彩)。消色差物镜通过绿色滤光片(通常是干涉滤光片)产生最佳效果,当这些物镜用于显微摄影时使用黑白胶片。缺乏对场平面度(或场曲率)的校正会进一步妨碍消色差物镜。在过去的几年中,大多数制造商已经开始为消色差物镜提供平场校正,并将这些校正后的物镜称为plan achromats。

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另一个较高的校正和成本水平被发现在被称为萤石或半消色层的物镜中(由图2中的中心物镜来说明),该物镜以矿物萤石命名,最初用于它们的建造。图2描述了三大类物镜:如上所述,校正量最小的消色差透镜;具有附加球面校正的萤石(或半消色差);以及可用的最高矫正物镜的复消色差镜片。位于图2最左侧的物镜是10倍消色差透镜,其包含两个内透镜双透镜和一个前透镜元件。在图2的中心示出了除了半球形前透镜和次级弯月透镜之外,具有包括两个双合透镜和三合透镜的几个透镜组的10x萤石物镜。图2右侧是10倍复消色差物镜,其中还包含多个镜头组和单个元件。尽管在结构上与萤石物镜相似,但透镜具有不同的曲率和厚度,并且被布置成对于复消色物镜物镜独特的配置。

Objective Correction for Optical Aberration


Objective
Type
Spherical
Aberration
Chromatic
Aberration
Field
Curvature
Achromat1 Color2 ColorsNo
Plan Achromat1 Color2 ColorsYes
Fluorite2-3 Colors2-3 ColorsNo
Plan Fluorite3-4 Colors2-4 ColorsYes
Plan Apochromat3-4 Colors4-5 ColorsYes

表格 1

在组装物镜期间,首先将镜片策略性地间隔开并且搭接固定到电池安装座中,然后将其包装在内部安装在物镜筒内的中央套筒中。单个镜头坐在黄铜肩台上,镜头在精密车床卡盘中旋转,然后用薄金属边缘抛光,将镜头(或镜头组)固定到位。通过选择适合下面两个透镜支架(半球形和弯月形透镜)之间的最佳隔垫组来校正球面像差。通过在套筒内用锁定螺母向上或向下平移整个透镜组使其达到一致,从而使置于多个物镜上的物镜可以互换而不会失去焦点。彗形像差的调整是通过三个定位螺钉完成的,它可以优化内部透镜组相对于物镜光轴的位置。

 

萤石物镜由先进的玻璃配方生产,其中含有诸如萤石或新型合成替代物等材料。这些新配方可以大大改善光学像差的校正。与消色差相似,萤石的物镜也可以用红色和蓝色光进行色彩校正。此外,萤石也可以通过球面校正两种或三种颜色,而不是像单色一样进行消色差校正。与消色差相比,萤石物镜的优越校正能够使这些物镜具有更高的数值孔径,从而获得更明亮的图像。萤石物镜也具有比消色差更好的分辨能力,并且提供更高的对比度,使得它们比用于白光中的彩色显微摄影的消色差更好。

校正(和费用)的最高级别可在复消色差物镜中找到,如图2和图3所示。复消色差镜代表目前可用的最高度校正的显微镜镜头,其高价格反映了其制造过程中所需的精密设计和精心组装。在图3中,我们比较了放大倍数从10倍到100倍不等的一系列复消色差物镜中的透镜元件。低功率复消色差物镜(10倍和20倍)具有更长的工作距离,整体物镜长度比更高倍率(40倍和100倍)复消色差物镜短。传统上,对于三种颜色(红色,绿色和蓝色),后解码器都进行了色彩校正,几乎消除了色差,并对两个或三个波长进行球面校正(参见表1)。复消色物镜是白光彩色显微照相的最佳选择。由于校正程度高,复消色差物镜通常具有比消色差或萤石更高的数值孔径。许多新型高性能萤石和复消色差物镜被校正四种(深蓝色,蓝色,绿色和红色)或更多颜色,四种颜色进行球形校正。

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所有这三种类型的物镜都受到明显的场曲和项目图像的弯曲而不是平坦,这是一种伪影,其严重程度随着放大率的增加而增加。为了克服由曲面镜片表面引起的这种内在条件,光学设计师制作了平场校正后的物镜,这些物镜在整个视场内产生了共同焦点的图像。具有平场矫正和低畸变的物镜称为平面光学平面镜,平面镜平面镜或平面镜,取决于它们的残余像差程度。这种校正虽然昂贵,但在数字成像和传统显微摄影中非常有价值。

未校正的场曲是在萤石(半消色差)和消色差物镜中发生的最严重的光学像差,并且作为多年来不可避免的伪像被容忍。在常规使用过程中,视场必须不断地在中心和边缘之间重新对焦以捕捉所有样本细节。平场(平场)校正物镜的完善使其用于显微摄影和视频显微镜,今天这些校正在普通用途和高性能物镜中都是标准的。如图4所示,使用简单的消色差,对场曲的校正为物镜添加了相当数量的透镜元件。图4左侧未经校正的消色差镜片除了包含一个简单的薄镜片前端元件外,还包含两个镜片双合透镜。相反,图4右侧的校正消色差图包含三个透镜双合透镜,一个中央透镜三合透镜组和一个位于半球形前透镜后面的弯月透镜。在这种情况下,平场校正导致将六个镜头元件捆绑到更复杂的镜头组中,这大大增加了物镜的光学复杂度。用于平面校正的透镜元件的显着增加也发生在萤石和复消色差物镜上,通常导致透镜元件(见图1)在内部物镜套筒内非常紧密配合。一般而言,校正场曲的平场物镜会牺牲相当大的自由工作距离,而且许多高倍率版本都有凹透镜,这可能非常难以清洁和维护。

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较旧的物镜通常具有较低的数值孔径,并且会受到称为色差的倍率差异的影响,需要使用专门设计的补偿目镜或目镜进行校正。这种类型的校正在固定管长度显微镜的统治期间普遍存在,但对于现代无限校正的物镜和显微镜来说不是必需的。近年来,现代显微镜的物镜可以对物镜本身(奥林巴斯和尼康)内置的放大倍率色差进行校正,或者在镜筒(莱卡和蔡司)中校正。

 

无穷远校正系统中的中间图像出现在光学通道中管透镜后面的参考焦距(以前称为光学管长度)处。这个长度在160到250毫米之间变化,这取决于制造商施加的设计限制。通过将参考焦距除以物镜的焦距来计算无穷远校正的物镜的放大率。

 

在大多数生物和岩石学应用中,盖玻片用于安装试样,既保护试样的完整性又提供清晰的观察窗口。盖玻璃的作用是会聚来自样品中每个点的光锥,但也会引起色差和球差(以及因此造成的对比度损失),这些都必须由物镜进行校正。光线会聚的程度取决于保护玻璃的折射率,色散和厚度。尽管在一批盖玻片内折射率应该相对恒定,但厚度可以在0.13和0.22毫米之间变化。另一个值得关注的问题是含水溶剂或过量安装介质位于样品和保护玻璃之间的潮湿或厚厚的制剂中。例如,在折射率与盖玻片的折射率显着不同的生理盐水中,物镜必须通过仅几微米厚的水层聚焦,导致显着的像差和不再对称的点扩散函数的偏差在焦平面的上方和下方。这些因素增加了盖玻片的折射率和厚度的有效变化,并且对于显微镜专家来说很难控制。

 

物镜前透镜和样品盖玻片之间的成像介质对于矫正物镜透镜元件设计中的球差和彗差也非常重要。较低功率的物镜具有相对较低的数值孔径,并且被设计成仅用空气作为物镜前透镜和盖玻璃之间的成像介质来使用。用空气获得的最大理论数值孔径为1.0,然而实际上实际上不可能产生数值孔径高于0.95的干燥物镜。对于数值孔径小于0.4的干物镜,盖玻片厚度变化的影响可以忽略不计,但是当数值孔径超过0.65时,这种偏差变得显着,其中小至0.01毫米的波动会引起球面像差。这对于高功率复消色差产生了问题,高功率复消色差必须在空气中使用非常短的工作距离并且包含对球差的敏感校正,这往往会使得难以获得清晰的图像。

为了解决这个问题,许多高性能的复消色差干物镜都配有校正环,通过校正防护玻璃厚度的变化,可以进行校正以校正球面像差(参见图5)。球面像差的光学校正通过旋转套环而产生,这导致物镜中的两个透镜元件组移动得更靠近或更远离。图5左侧的物镜通过将可调透镜元件非常靠近在一起,对校正环进行了调整,以使盖玻璃厚度为0.20毫米。相比之下,图5右侧的物镜具有可调整的透镜元件,相隔较远的距离以补偿非常薄的覆盖玻璃(0.13 mm)。大多数设计用于直立式透射光显微镜的校正项目物镜的覆盖玻璃厚度变化范围为0.10至0.23毫米。许多为倒置显微镜观察组织培养标本而设计的专门相位差物镜具有更宽的0-2毫米补偿范围。这样可以通过大多数培养皿的底部观察标本,这些标本在这个尺寸范围内通常具有显着的厚度波动。当调整设置为0以考虑到缺少盖玻片时,还可以观察到未涂覆的标本(如血涂片),并校正项圈物镜。

 

缺少校正环的高数值孔径干物镜通常产生的图像低于较低数值孔径物镜的图像,其中盖玻璃厚度不太受关注。出于这个原因,选择较低的放大倍数(和数值孔径)物镜以获得优异的对比度而没有盖玻片波动引起的伴随伪影通常是谨慎的。例如,具有0.65的数值孔径的40x物镜可以产生比60x-0.85数值孔径物镜更清晰的对比度和清晰度的更好的图像,尽管更高放大倍数物镜的分辨能力在理论上更大。

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盖玻片的标准厚度为0.17毫米,被指定为1 1/2盖玻片。不幸的是,并非所有1½盖玻片都是按照这种紧密公差制造的(它们的范围从0.16到0.19毫米),并且许多标本在它们和盖玻片之间都有介质。通过调整显微镜的机械管长度或者(如之前所讨论的)通过利用改变物镜筒内关键元件之间间距的专用校正环来实现对盖玻片厚度的补偿。修正领被用来调整这些微妙的差异,以确保最佳的客观表现。正确使用带有校正环的物镜要求显微镜专家具有足够的经验和警觉,以便使用适当的图像标准重新设置环。在大多数情况下,焦点可能会改变,并且在校正项圈的调整过程中图像可能会漂移。使用下列步骤对物镜的校正环进行小幅度增量调整,同时观察样本图像的变化。

 

放置校正环,使物镜桶上的指示标记与刻在环套上的0.17毫米刻度标记重合。

在舞台上放置一个标本,并将显微镜对准一个小的标本特征。

轻微转动校正环,然后重新聚焦物镜以确定图像是否有所改善或降级。由于大多数标本制备过厚的盖玻片/介质三明治,因此首先尝试更大的补偿值(0.18-0.23)开始旋转实验。

重复之前的步骤,以确定图像是否正在改进或降级,因为校正环是朝单一方向转动的。

如果图像质量下降,请遵循相同的步骤,并沿相反方向(朝向较低值)旋转校正环以找到提供最佳分辨率和对比度的位置。

通过设计与浸油介质(如油,甘油或水)一起使用的物镜,可以显着提高客观数值孔径。通过使用折射率与玻璃盖玻片的折射率相似的浸渍介质,实际上消除了由于玻璃盖厚度变化引起的图像劣化,由此宽的倾斜射线不再经历折射并且更容易被物镜抓住。典型的浸油具有1.51的折射率和类似于玻璃盖玻片的分散。穿过样本的光线在盖玻片和浸油之间遇到均匀介质,并且在它们进入透镜时不会折射,而只是在它们离开其上表面时折射。由此可见,如果将样品放置在第一物镜的无平面点(在焦点处和场中心),则通过该部分透镜系统的成像完全没有球面像差。

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实际油浸物镜的一般设计包括一个半球形前透镜元件,其后是一个正弯月透镜和一个双透镜组。图6中显示了典型的复消色油浸物镜中前两个透镜元件发生的平面内折射。标本夹在显微镜载玻片和保护玻璃之间P点,即半球形透镜元件的无光点。在半球形透镜后方折射的光线看起来从点P(1)开始,该点也是弯月形透镜的第一表面的曲率中心。折射光线沿其第一表面的半径进入弯月形透镜,并且在该表面处没有折射。在弯月透镜的后表面,光线被平面地折射,因此它们似乎从P(2)点偏离。物镜中随后的透镜组表面处的光线的折射完成了源自点P的光线的会聚,从而形成中间图像。

 

正确设计的油浸物镜也能校正由前两个透镜元件引入的彩色缺陷,同时引入最小量的球面像差。光锥在进入第一透镜元件之前部分会聚的事实有助于控制球面像差。应该注意的是,在盖玻片和第一透镜元件之间没有施用油的情况下采用油浸物镜会导致图像缺陷。这是由于在前透镜表面发生的折射,这引起球差,而后者在物镜内部的透镜组件无法校正。

 

如果使用错误的浸没液体,油浸物镜的优点会受到严重影响。显微镜制造商生产的物镜对折射率和色散具有严格的公差,这要求在盖玻片和物镜前透镜之间的液体中具有匹配值。建议仅使用物镜制造商提供的油,并且不要在制造商之间混合浸油,以避免令人不快的伪像,如结晶或相分离。

 

使用水和/或甘油作为成像介质的物镜也可用于培养中的活细胞或浸入生理盐水溶液中的组织切片。平场复消色差水浸镜头配备了校正环和数值孔径高达1.2,略低于其油浸对应物。这些物镜允许显微镜专家通过高达200微米的水性介质进行对焦,并保持出色的光学校正。不足之处在于高数值孔径的水浸镜头通常需要花费数千美元,并且当物镜通过折射组织或细胞部件深入聚焦时,图像仍然可能会降级。有关水,甘油和油浸物镜的更多详细信息,请访问我们关于浸入式介质的显微镜底漆部分。

物镜桶上刻有大量信息,正如我们在关于规格和物镜识别的章节中所讨论的那样。简而言之,每个物镜上都放有放大倍数(例如10倍,20倍或40倍等)。物镜设计的管长为其最佳图像(通常为160毫米或希腊无穷大符号);以及保护样品的保护玻璃的厚度,假设设计者在校正球面像差(通常为0.17毫米)时具有恒定值。如果物镜设计为在其与样品之间有一滴油的情况下操作,则物镜上将刻有OIL或OEL或HI(均匀浸泡)。如果这些后面的名称不刻在物镜上,则物镜应该是干燥的,物镜的最低部分与样品之间有空气。物镜也总是带有数值孔径(NA)值的雕刻。这可能从低功率物镜的0.04到高功率油浸复消色差物镜的1.3或1.4变化。如果物镜没有指定更高的修正,通常可以认为它是一个消色差物镜。更高度校正的物镜具有诸如复消色差或apo,平场,FL,荧光等的铭文。较老的物镜通常在镜筒上刻有焦距(镜头对图像的距离),这是放大率的量度。在现代显微镜中,物镜被设计用于特定的光学管长度,因此在镜筒上包括焦距和放大倍率都变得多余。

 

2列出了四种最常见的物镜类型的工作距离和数值孔径与放大率的关系:消色差,平面光学,平面荧光和平面色差。请注意,干物镜的数值孔径值均小于1.0,只有为液浸介质设计的物镜的数值孔径超过此值。

Objective Specifications by Magnification


MagnificationNumerical ApertureWorking Distance (mm)
Achromat
4x0.1030.00
10x0.256.10
20x0.402.10
40x0.650.65
60x0.800.30
100x (oil)1.250.18
Plan Achromat
0.5x0.027.00
1x0.043.20
2x0.067.50
4x0.1030.00
10x0.2510.50
20x0.401.30
40x0.650.57
50x (oil)0.900.40
100x (oil)1.250.17
40x0.650.48
100x0.900.26
Plan Fluorite
4x0.1317.10
10x0.3016.00
20x0.502.10
40x0.750.72
40x (oil)1.300.2
60x0.850.3
100x (dry)0.900.30
100x (oil)1.300.20
100x (oil with iris)0.5-1.30.20
Plan Apochromat
2x0.108.50
4x0.2015.70
10x0.454.00
20x0.751.00
40x0.950.14
40x (oil)1.000.16
60x0.950.15
60x (oil)1.400.21
60x
(water immersion)
1.200.22
100x (oil)1.400.13
100x (NCG oil)1.400.17
NCG = No Cover Glass
表格 2


当制造商的一组匹配物镜,例如所有不同放大倍数的消色差物镜(表2中列出的物镜的一个子集)都安装在鼻镜上,通常用于将图像投影到身体管中大致相同的平面上。因此,通过旋转鼻镜来改变物镜通常只需要使用微调旋钮来重新建立清晰的焦点。这样一组物镜被描述为一致的,一种有用的便利和安全特征。匹配的物镜组也被设计为是中心的,因此当物镜转动到另一个物镜时,一个物镜的视场中心的样品仍保持居中。

 

多年来,大多数制造商针对生物应用设计的物镜都符合国际标准焦距。因此,大多数物镜具有45.0毫米的齐焦距离并被认为是可互换的。随着向无限校正管长度的过渡,出现了一套新的设计标准来校正物镜和管透镜的像差。再加上对更大灵活性的需求增加,以适应更高工作距离以及更高数值孔径和场尺寸的需要,来自不同制造商的物镜之间的互换性消失。尼康CFI-60光学系统以“无铬”物镜,镜筒和目镜为特征,展示了这种转变。 CFI-60系统中的每个组件都单独修正,而不用于修正另一个组件。使用管透镜将管长度设置为无穷远(平行光路),并且齐焦距离已经增加到60毫米。即使是客观的安装螺纹尺寸已经从20.32变为25毫米,以满足光学系统的新要求。

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光学显微镜中的视场直径由视场数或简单视场数表示,视场数是以毫米为单位表示的并在中间像平面处测量的视场直径。物体(样本)平面中的场直径成为场数除以物镜的放大倍数。尽管场数通常受到目镜(目镜)视场光阑的放大率和直径的限制,但物镜的设计显然也存在限制。在早期的显微镜物镜中,最大可用视场直径被限制在18毫米左右(或者对于高倍率目镜来说要小得多),但是现代平面显微镜和其他专业平场物镜通常具有22到28毫米的可用视场,或者更多的时候与广角目镜相结合。不幸的是,最大有用的场数并不是通常刻在物镜筒上,也不在显微镜目录中列出。

 

物镜可以聚焦而没有任何明显的图像清晰度变化的轴向范围称为物镜景深。这个值从低到高的数值孔径物镜发生根本性变化,通常随着数值孔径的增加而减小(见表3和图7)。在高数值孔径处,景深主要由波光学器件决定,而在较低数值孔径处,几何光学“混淆圈”占主导地位。总景深由场的波和几何光学深度之和给出,如下所示:

 

dtot =λn/ NA2 +(n / M·NA)e

其中λ是照明的波长,n是成像介质的折射率,NA是客观数值孔径,M是客观横向放大倍数,并且e是可以通过放置在探测器中的探测器解析的最小距离物镜的图像平面。请注意,衍射极限景深(方程右侧的第一项)与数值孔径的平方成反比,而分辨率的横向极限随着数值孔径的第一次方而减小。结果是轴向分辨率和光学部分的厚度受系统数值孔径的影响远大于显微镜的横向分辨率(见表3)。

Depth of Field and Image Depth
MagnificationNumerical ApertureDepth of Field
(µm)
Image Depth
(mm)
4x0.1015.50.13
10x0.258.50.80
20x0.405.83.8
40x0.651.012.8
60x0.850.4029.8
100x0.950.1980.0
表格 3

保护玻璃最近的表面和物镜前透镜之间的间隙距离称为工作距离。在样品被设计成不用盖玻片成像的情况下,在样品的实际表面处测量工作距离。一般来说,随着放大倍率和数值孔径的增加,工作距离在一系列匹配的物镜中减小(见表2)。只要满足数值孔径要求,旨在将空气样本视为成像介质的物镜应尽可能长的工作距离。另一方面,浸没物镜应具有较浅的工作距离,以便在前镜片和样品之间容纳浸没液体。许多设计在近距离工作距离的物镜都有一个弹簧加载的收缩挡块,通过将前端镜头组件推入物镜本体并扭转以将其锁定到位,可使其缩回。当物镜在鼻托中旋转时,这样的附件很方便,因此它不会将浸油浸在干净的载玻片表面。以相反的方向扭回缩止动器会释放镜头组件以供使用。在某些应用中(见下文),长时间的自由工作距离是必不可少的,并且特殊物镜被设计用于这种使用,尽管难以实现大的数值孔径和必要的光学校正程度。

 

近年来客观设计中最重要的进步之一是抗反射涂层技术的改进,该技术有助于减少光线通过透镜系统时发生的不需要的反射。每个未涂覆的空气 - 玻璃界面可以反射垂直于表面的入射光束的4%到5%,导致正常入射时透射值为95-96%。应用具有适当折射率的四分之一波长厚度抗反射涂层可以将该值减小三至四个百分点。随着透镜元件数量的不断增加,物镜变得更复杂,消除内部反射的需求也相应增加。一些具有高度校正的现代物镜可以包含多达15个具有多个空气 - 玻璃界面的透镜元件。如果镜片没有涂层,单独的轴向射线的反射损失会使透射率值下降到50%左右。曾经用于减少眩光并改善透射率的单层透镜涂层现在已被多层涂层所取代,该多层涂层在可见光谱范围内产生超过99.9%的透射率值。

 

8中示出了反射和/或穿过涂覆有两个抗反射层的透镜元件的光波的示意图。入射波以一定角度撞击第一层(图3中的层A),导致部分光被反射(R(o)),并且部分透射通过第一层。在遇到第二抗反射层(层B)时,另一部分光以相同的角度反射并干扰从第一层反射的光。一些剩余的光波继续到玻璃表面,在那里它们又被反射和传播。从玻璃表面反射的光与从抗反射层反射的光干涉(构造性地和破坏性地)。抗反射层的折射率不同于玻璃和周围介质(空气)的折射率。当光波穿过抗反射层和玻璃表面时,大部分光(取决于通常在光学显微镜中垂直于透镜的入射角)最终透过玻璃并聚焦以形成图像。

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氟化镁是用于薄层光学增透膜的许多材料之一,但大多数显微镜制造商现在都生产他们自己的专有配方。总体结果是可见波长的对比度和透射率的显着提高,以及位于传输带外的谐波相关频率的并发破坏性干扰。这些专业涂层很容易被误操作损坏,显微镜专家应该意识到这个漏洞。与单层涂层的紫色色彩相反,多层减反射涂层具有略带绿色的色调,这一观察结果可用于区分涂层。用于内部透镜的抗反射涂层表面层通常比用于保护外部透镜表面的相应涂层柔软得多。清洁涂有薄膜的光学表面时应格外小心,特别是在拆卸显微镜并对内部透镜元件进行检查的情况下。

 

镜头系统的焦距定义为从镜头中心到平行光线聚焦在光轴上的点(通常称为主焦点)的距离。垂直于主焦点的假想平面被称为透镜系统的焦平面。每个镜头都有两个主要焦点,每个侧面都有光线,一个在前面,一个在后面。按照惯例,更接近前透镜元件的物镜焦平面称为前焦平面,位于物镜后方的焦平面称为后焦平面。后焦平面的实际位置随着客观结构而变化,但通常位于物镜筒内部的某个位置用于高放大率物镜。较低放大倍率的物镜通常有一个位于枪管外部的后焦平面,位于螺纹区域或显微镜鼻梁内。

 

当光线穿过物镜时,它们受到物镜后孔或出瞳的限制。对于最大功率消色差物镜,此孔径的直径在12毫米之间,对于低倍率物镜,直至5毫米左右。对于落射照明应用来说,光圈大小是非常关键的,依赖于物镜既可以作为成像系统也可以作为聚光器,出射光瞳也可以成为入瞳。光源的图像必须完全填充物镜的后光圈,以在整个视场内产生均匀的照明。如果光源图像小于光圈,则视场会因光照不均而出现晕影。另一方面,如果光源图像大于后孔径,则一些光线不会进入物镜,并且照明强度降低。

 

总之,Ernst Abbe开发了高质量显微镜物镜,Ernst Abbe在19世纪80年代后期首先与Carl Zeiss和Otto Schott合作开发了复消色差物镜并补偿了目镜。客观设计的下一个重大进展发生在Hans Boegehold(蔡司)在20世纪30年代末建造了第一个平场消色差和平场复消色差物镜。最近,Zenji Wahimoto(尼康)和Horst Riesenberg(蔡司)开发的“Chrome Free”(CF)光学镜头已经引发了显微镜物镜设计的新革命。

 

如果选择合适的物镜并正确使用,许多目前生产的显微镜物镜都具有显着低的像差和其他缺陷。尽管如此,显微镜专家需要意识到,从各个角度来看,物镜并非完美无瑕,而是根据预期用途,物理尺寸限制和价格范围而设计,以满足一定的规格。因此,针对色差和球差,场大小和平坦度,透射波长,不受荧光影响,双折射以及其他导致背景噪声的因素进行了不同程度的校正。此外,它们被设计为在特定的限制条件下使用,例如特定的管长度和管透镜,浸入式介质的类型和厚度以及盖玻片,波长范围,现场尺寸,眼睛类型和特殊聚光镜。光学显微镜的最终物镜是提供有用的放大倍率,使得可以非常详细地观察微小的样本,从而暴露隐藏的不可见物体的世界,否则这些物体将不可见。


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